专题二 基因工程的应用

1、1n第一节第一节 概述概述n第二节第二节 基因工程药物生产过程基因工程药物生产过程 常用的工具酶常用的工具酶 常用的克隆载体常用的克隆载体 目的基因的获得目的基因的获得 目的基因与克隆载体的体外重组目的基因与克隆载体的体外重组 目的重组克隆的筛选、鉴定与分析目的重组克隆的筛选、鉴定与分析 目的基因在宿主细胞中的表达目的基因在宿主细胞中的表达 基因工程菌（细胞）的培养与发酵基因工程菌（细胞）的培养与发酵n第三节第三节 转基因动物制药转基因动物制药n第四节第四节 转基因植物制药转基因植物制药2第一节第一节 概述概述n基因工程在制药中作用基因工程在制药中作用n基因工程药物的主要类别基因工程药物的主要

2、类别n基因工程生产药物的优点基因工程生产药物的优点n国内外基因工程药物发展简述国内外基因工程药物发展简述3 基因工程基因工程: 是通过对是通过对Nucleic acid 分子的分子的Insert, Assemble and Recombinant而实现遗传物质（而实现遗传物质（germ plasm）的重新组合，再借助）的重新组合，再借助Virus，Bacterium，Plasmid or other Vectors，将，将Target gene转移到新的转移到新的 Host Cell System，并使，并使Target Gene在新的在新的Host cell system 进行进行Repli

3、cation and 的技术。的技术。 基因工程技术最成功的成就基因工程技术最成功的成就:4 A、材料来源困难或制造技术问题而无法付诸、材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用；应用； B、从动物脏器中提取出来，也因造价太高，、从动物脏器中提取出来，也因造价太高，或因来源困难而供不应求；或因来源困难而供不应求； C、由于免疫抗原、病毒感染等缘故，使它们、由于免疫抗原、病毒感染等缘故，使它们在使用上受到限制。在使用上受到限制。 一、传统制药存在的问题一、传统制药存在的问题51、可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白、可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白 质，为临床使用提供有效的保障；可

4、避免免疫抗原质，为临床使用提供有效的保障；可避免免疫抗原 性及病毒污染（人生长激素性及病毒污染（人生长激素 克雅病克雅病CJD） 2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生 理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物 质的应用范围；质的应用范围； 3、利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性、利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性 生理活性物质；生理活性物质；二、基因工程在生物技术制药中的作用二、基因工程在生物技术制药中的作用64、内源性生理活性物质在作为药物使用时存在、内源性生理活性物质在作为药物

5、使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造；进行改造；IL-2,125半胱氨酸半胱氨酸丝氨丝氨 酸提高活酸提高活性及稳定性；性及稳定性；tPA缩小分子延长半衰期缩小分子延长半衰期5、利用、利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。药物筛选来源。76、为新药研发提供了新途径和新技术，极大的提、为新药研发提供了新途径和新技术，极大的提高了药物研发速度，缩短药物研发速度。高了药物研发速度，缩短药物研发速度。 7、促进传统制药工业的技术改造，为制药工业提、促进传统制药工业的技术改造，为制药工业提供供新技

6、术。新技术。8三、基因工程药物发展简史三、基因工程药物发展简史n1976年世界第一家应用年世界第一家应用DNA重组技术研究新药的重组技术研究新药的公司美国公司美国Genentech公司成立；公司成立；n1982年欧洲首先批准年欧洲首先批准DNA重组的动物疫苗抗球虫重组的动物疫苗抗球虫病疫苗；病疫苗；n1982，美国，英国批准生产和使用了第一个基因，美国，英国批准生产和使用了第一个基因工程药物人胰岛素。工程药物人胰岛素。9Genentech 公司公司 1976年，年，27岁的风险投资人岁的风险投资人Robert Swanson与与University of California的教授的教授Her

7、b Boyer共共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为Genentech（Genetic Engineering Technology）。）。第一个基因工程公司在学术界和商业界第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！的满腹怀疑中诞生了！10GenentechGenentech的骄人业绩的骄人业绩1976Genentech创立创立1977首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素1978克隆了人胰岛素基因克隆了

8、人胰岛素基因1979克隆了人生长激素素基因克隆了人生长激素素基因1980公司上市，募集公司上市，募集$ 35 million1982第一个第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给基因重组药（人胰岛素）上市（转让给Lilly公司）公司）1984第一个第一个VIII因子，转让给因子，转让给Cutter Biological1985第一个第一个自己生产的产品（人生长激素）自己生产的产品（人生长激素）1987生产组织纤溶酶原激活剂（生产组织纤溶酶原激活剂（tPA）1990生产生产interferon 1 1990与瑞士与瑞士Roche医药公司合并（医药公司合并（$ 2.1billion）11美国已批准

9、上市的基因工程药物（美国已批准上市的基因工程药物（1997.7）中文名称中文名称商品名称商品名称英文名缩写英文名缩写开发公司开发公司胰岛素胰岛素Humulin Novolin HumalogInsulin lispoinsulinLilly Novo Nordisk Lilly人生长激素人生长激素Protropin Humatrope NutropinAQrhuGHGenentech Lilly Genentech干扰素干扰素IntronA ReferonA Avonix Betaseron Actimmune Alferon-NrhuIFNa2b rhuIFNa2a rhuIFN rhuIF

10、N 1b rhuIFN 1b rhuIFNa3Schering Roche Biogen Chiron Genentech Interferon Science12白细胞介素白细胞介素2ProleukinrhuIL2Chiron粒细胞集落刺激因粒细胞集落刺激因子子NeupogenrhuG-CSFAmgen粒细胞巨噬细胞集粒细胞巨噬细胞集落刺激因子落刺激因子LeukinerhuGM-GSFImmunex红细胞生成素红细胞生成素Epogen ProcritrhuEPO Amgen Ortho组织溶纤原激活剂组织溶纤原激活剂ActivaserhuTPAGenentech生长激素生长激素Serosti

11、nsomatotropinSerono促生长素促生长素Nutropin Saizen Genotropin Norditropin Bio-TropinsomatopinGenentech Serono Pharma/Upjohn Novo Nordisk Biotech General13抗血友病因子抗血友病因子VIIIKogenate RecombinateFactor VIIIBayer Baxter葡萄脑苷脂酶葡萄脑苷脂酶CerezymeglucocerebrosidaseGenzyml脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶PulmozymedomaseGenentech乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗

12、RecombivaxHB Engerix B ComraxHepatitis B vaccineMerck Smith Kline Merck甲型肝炎疫苗甲型肝炎疫苗HavrixHepatitis B vaccineSmith Kline14“863863”高技术计划在生物技术领域研究的三个主题之高技术计划在生物技术领域研究的三个主题之一是：一是：，重点是利用现，重点是利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生产的药品。代生物技术手段，开发化学合成法难以生产的药品。王大珩王大珩中国科学院院士，中国科学院院士，中国工程院院士，中国工程院院士，我国应用光学及我国应用光学及光学工程的主要光学工程的主

13、要奠基人之一。奠基人之一。王淦昌王淦昌中国科学院院中国科学院院士、著名高能士、著名高能物理学家。物理学家。杨嘉墀杨嘉墀中国科学院院中国科学院院士，著名空间士，著名空间自动控制专家。自动控制专家。 陈芳允陈芳允中国科学院院中国科学院院士，著名电子士，著名电子学家。学家。 “十五十五”期间，期间，863计划选择了信息技术、生物和现代农业技术、新材料、先计划选择了信息技术、生物和现代农业技术、新材料、先进制造与自动化技术、能源技术、资源环境技术等进制造与自动化技术、能源技术、资源环境技术等6个高技术领域个高技术领域 。15基因工程药物的种类：基因工程药物的种类：1、免疫性蛋白：各种抗原和单克隆抗体、

14、免疫性蛋白：各种抗原和单克隆抗体2、细胞因子：干扰素，白介素，集落刺激、细胞因子：干扰素，白介素，集落刺激 因子，表皮生长因子及凝血因子。因子，表皮生长因子及凝血因子。3、激素：胰岛素，心钠素，生长激素。、激素：胰岛素，心钠素，生长激素。4、酶类：尿激酶，链激酶，葡激酶。、酶类：尿激酶，链激酶，葡激酶。16我国已批准上市的基因工程药物和疫苗我国已批准上市的基因工程药物和疫苗产品名称产品名称适应症适应症开发及生产单位开发及生产单位批准时间批准时间重组人干扰素重组人干扰素1b（外用）外用）病毒性角膜炎病毒性角膜炎长春生物制品研究所长春生物制品研究所1989年试生产年试生产重组人干扰素重组人干扰素1

15、bHBV、HCV上海生物制品研究所等上海生物制品研究所等1996年年重组人干扰素重组人干扰素2a尖锐湿疣，疱疹尖锐湿疣，疱疹等，等， HBV、HCV新大洲药业等新大洲药业等1997年年重组人干扰素重组人干扰素2bHBV、HCV安徽安科生物工程股份安徽安科生物工程股份有限公司等有限公司等1997年试生产年试生产重组人干扰素重组人干扰素类风湿类风湿丽珠医药（集团）有限丽珠医药（集团）有限公司生物工程公司等公司生物工程公司等1995年试生产年试生产重组人白介素重组人白介素2癌症辅助疗法癌症辅助疗法长春生物制品研究所等长春生物制品研究所等1997年试生产年试生产重组人巨噬细胞粒重组人巨噬细胞粒细胞集落

16、刺激因子细胞集落刺激因子（GM-CSF）化疗生白细胞化疗生白细胞厦门特宝等厦门特宝等1997年试生产年试生产重组人粒细胞集落重组人粒细胞集落刺激因子刺激因子化疗生白细胞化疗生白细胞杭州九源基因公司等杭州九源基因公司等1996年试生产年试生产17我国已批准上市的基因工程药物和疫苗我国已批准上市的基因工程药物和疫苗产品名称产品名称适应症适应症开发及生产单位开发及生产单位批准时间批准时间重组尿激酶重组尿激酶心肌梗死溶栓心肌梗死溶栓医大实业（上海）医大实业（上海）1996年试生产年试生产重组人红细胞生成重组人红细胞生成素（素（EPO）再生障碍性贫血再生障碍性贫血南京华欣等南京华欣等1997年试生产年试

17、生产重组人胰岛素重组人胰岛素糖尿病糖尿病通化安泰克通化安泰克1998年年重组人生长激素重组人生长激素儿童侏儒症儿童侏儒症长春金赛等长春金赛等1998年试生产年试生产重组碱性成纤维细重组碱性成纤维细胞生长因子胞生长因子创伤、烧伤创伤、烧伤珠海东大珠海东大1996年试生产年试生产乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗预防乙肝预防乙肝华北制药集团有限责任华北制药集团有限责任公司等公司等重组痢疾菌苗重组痢疾菌苗预防痢疾预防痢疾军事医学科学院军事医学科学院1998年获新药证年获新药证书书重组表皮生长因子重组表皮生长因子创伤外用创伤外用中国医学科学院基础医中国医学科学院基础医学研究所学研究所2000年获新药证年获新药证

18、书书18基因工程生产药物的优点：基因工程生产药物的优点：1、收获量大，更有效服务社会。、收获量大，更有效服务社会。2、生产效率更高、生产效率更高3、进一步改良药理活性，例：蛋白质工程、进一步改良药理活性，例：蛋白质工程4、有利于获得新药：筛选新型化合物、有利于获得新药：筛选新型化合物5、.？19l 稀少珍贵的蛋白质药物稀少珍贵的蛋白质药物 1982年，美国食品与药物管理局批准了首例基年，美国食品与药物管理局批准了首例基因工程产品因工程产品-人胰岛素投放市场，它标志了基因人胰岛素投放市场，它标志了基因工程产品正式进入到商业化阶段。工程产品正式进入到商业化阶段。 人生长激素、表皮生长因子、肿瘤坏死

19、因子、人生长激素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、a-干扰素、纤维素酶、抗血友病因子、红细胞干扰素、纤维素酶、抗血友病因子、红细胞生成素、尿激酶原、白细胞介素生成素、尿激酶原、白细胞介素-2、集落刺激、集落刺激因子、乙肝疫苗等等因子、乙肝疫苗等等20l 畜牧业中的应用畜牧业中的应用 动物疫苗、生长激素等动物疫苗、生长激素等 例：从转基因羊的羊奶例：从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的中提取出治疗心脏病的药物药物tPA21l 种植业中的应用种植业中的应用 用携带外源基因的农杆菌用携带外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生质体，使质粒转化植物原生质体，使外源外源DNA与植物染色体与植物染色体DNA整合，

20、通过原生质体的培养整合，通过原生质体的培养分化成愈伤组织，最后发育成具有新性状的完整植株分化成愈伤组织，最后发育成具有新性状的完整植株转基因植物转基因植物22l 种植业中的应用种植业中的应用 抗化学除草剂基因抗化学除草剂基因 转基因西红柿转基因西红柿 固氮酶基因固氮酶基因 人类人类DNA l 环境保护等等环境保护等等23n常用的工具酶常用的工具酶n常用的克隆载体常用的克隆载体n目的基因的获得目的基因的获得n目的基因与克隆载体的体外重组目的基因与克隆载体的体外重组n目的重组克隆的筛选、鉴定与分析目的重组克隆的筛选、鉴定与分析n目的基因在宿主细胞中的表达目的基因在宿主细胞中的表达n基因工程菌（细胞

21、）的培养与发酵基因工程菌（细胞）的培养与发酵n产物分离纯化、除菌过滤产物分离纯化、除菌过滤n半成品检定半成品检定n包装包装24第二节第二节 基因工程制药的基本过程基因工程制药的基本过程上游阶段上游阶段下游阶段下游阶段基因工程制药由上游工程和下游工程组成。基因工程制药由上游工程和下游工程组成。上游工程是研究开发必不可少的环节，主要在实验室内完成。包括目的上游工程是研究开发必不可少的环节，主要在实验室内完成。包括目的基因的分离、重组质粒的构建、组建基因工程菌基因的分离、重组质粒的构建、组建基因工程菌 ( (或细胞或细胞) ) 等程序。等程序。下游工程是把上游工程成果产业化的过程。包括确立工程菌株或

22、细胞株下游工程是把上游工程成果产业化的过程。包括确立工程菌株或细胞株大规模发酵的最佳参数、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置大规模发酵的最佳参数、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术、生物传感器等的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术、生物传感器等一系列设备的制造、电子计算机的优化控制等。一系列设备的制造、电子计算机的优化控制等。基因工程药物制造的主要步骤：基因工程药物制造的主要步骤：2526一、常用的工具酶一、常用的工具酶基因工程常用工具酶主要包括如下：基因工程常用工具酶主要包括如下：1、限制性内切酶、限制性内切酶3、连接酶

23、、连接酶2、DNA聚合酶聚合酶4、其它修饰酶、其它修饰酶27 定义：指能识别定义：指能识别特定的特定的DNA序列序列并在一定的并在一定的条件下可在识别位置或附近条件下可在识别位置或附近对对DNA 进行切割进行切割的酶。的酶。1 1、限制性内切酶、限制性内切酶 (restriction endonuclase)28 限制性内切酶的种类限制性内切酶的种类 限制性活性限制性活性 + + +甲基化酶活性甲基化酶活性 + - +DNA识别序列识别序列 + + +切割特异性切割特异性 随机随机 专一专一 切割位点距识别切割位点距识别 位点位点10-25bP对对ATP依赖性依赖性 + - +对对Mg2+依赖

24、性依赖性 + + +蛋白质结构蛋白质结构 3种不同亚基种不同亚基 单一成分单一成分 2种不同的亚基种不同的亚基 29 限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名命名规则：命名规则：寄主菌寄主菌属名属名的第的第1 1个字母个字母种名种名的前两个的前两个字母字母菌株或菌型菌株或菌型代号（大写）空白代号（大写）空白发现序列发现序列（罗马数字）（罗马数字）例子：例子： EcoR(E：属名；：属名；co：种名；：种名；R：株；：株；：发：发现次序现次序)30属名属名 种名种名 菌株菌株Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌d株株H in dH i n d III同一

25、菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶。同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶。例子例子注意注意斜体！斜体！31 型酶的特性：型酶的特性：（1）识别序列：）识别序列：4-8碱基的特异序列，通碱基的特异序列，通 常具有回文结构：常具有回文结构：如如 EcoRIGGCCA A T TT T A A32B、平头末端平头末端（blunt end）: 切割点位于识别位点的中间，切断的切割点位于识别位点的中间，切断的DNA片片断具有平齐的末端断具有平齐的末端（2）切割方式：两种）切割方式：两种A、粘性末端粘性末端（sticky end）: 两条两条DNA链上的切割点不一致，切断的链上的切割点不一致，切

26、断的DNA片断的末端上含有一条多个核苷酸的单链，片断的末端上含有一条多个核苷酸的单链，包括包括5端凸出和端凸出和3端凸出。端凸出。331）产生）产生 5端凸出粘性（如端凸出粘性（如EcoR I切点）切点）CTTAAGGAATTC 5-3 3-5 CTTAA G G AATTC 5-3 3-5 A、产生粘性末端、产生粘性末端342）产生）产生3 粘性粘性末末端：如末末端：如PstI5-3 3-5 CTGCA G G ACGTC CTGCAG GACGTC 5-3 3-5 35B、 产生平末端：产生平末端：-TTT AAA-AAA TTT- TTT AAA - AAA TTT -CCCGGGGGG

27、CCC5355CCCGGGGGGCCC3353DraISmaI36A、完全同裂酶：、完全同裂酶： 识别位点和切点识别位点和切点完全相同完全相同，如，如Hind 和和Hsu I。识别序列识别序列相同相同，切割位点有些，切割位点有些相同相同，有些，有些不同不同。（3）同裂酶）同裂酶37Xma I：5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5 Sma I： 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 识别位点相同，但切点不同。识别位点相同，但切点不同。 如如Xma I 和和 Sma I。B、不完全同裂酶：、不完全同裂酶：38 来源不同，识别的序列不同，但能切出来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的

28、粘性末端相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。如连接后不能被相关的酶同时切割。如BamH I、Bgl、Xho等。等。U代表嘌呤；代表嘌呤；Y代表嘧啶代表嘧啶（4）同尾酶（同尾酶（Isocaudamers）39限制性内切限制性内切酶活性单位酶活性单位U ： 限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。一性。 限制性内切酶活性限制性内切酶活性: 在建议使用在建议使用Buffer、温度下，在、温度下，在20uL反应体系中反应体系中1小小时使时使

29、1g 入入DNA完全酶切完全酶切所需的酶。所需的酶。40星星活性（星星活性（star activity）: 在在非最适合非最适合的条件下酶的的条件下酶的识别特异性降低识别特异性降低，产生，产生非特异性带非特异性带，这种活性称星活性。，这种活性称星活性。限制性内切酶在使用中，使用不当，会出限制性内切酶在使用中，使用不当，会出现所谓的现所谓的星星活性星星活性。注意！注意！41DNA中的杂质如中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。等都会影响酶的活性。 1）DNA的纯度的纯度 影响限制性内切酶活性的因素影响限制性内切酶活性的因素2）DNA的甲基化

30、程度的甲基化程度 dam甲基化酶甲基化酶（修饰（修饰GATC中的中的A）；）； dcm甲基化酶甲基化酶（修饰（修饰CCA/TGG的的C）。）。423）温度）温度 不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是大多数是37 oC或或28 oC ，少数要求，少数要求40-65 oC。是影响限制酶活性的重要因素。是影响限制酶活性的重要因素。4）缓冲液（）缓冲液（Buffer） 商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。MgCl2、NaCl/KCl： 提供提供Mg2+和离子强度；和离子强度； Tris-HCl： 维持维持pH； 二硫苏

31、糖醇（二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；等：有助于酶的稳定；巯基乙醇巯基乙醇：保持酶的稳定性，防止酶失活。：保持酶的稳定性，防止酶失活。43n用时在冰上操作；用时在冰上操作；n取酶用干燥、灭菌、新的枪头取酶用干燥、灭菌、新的枪头n酶用量不能超过酶切总体积的酶用量不能超过酶切总体积的10%；n多种酶进行酶切时，多种酶进行酶切时，先低盐后高盐先低盐后高盐缓冲液；缓冲液；关心小贴关心小贴士告诉你士告诉你 使用时注意事项：使用时注意事项：442、连接酶（、连接酶（Ligase)连接酶种类：连接酶种类：DNA连接酶连接酶和和RNA连

32、接酶连接酶DNA连接酶连接酶： T4 DNA连接酶和大肠杆菌连接酶连接酶和大肠杆菌连接酶DNA连接酶功能：连接酶功能： 间断修复间断修复 连接作用连接作用45A、大肠杆菌连接酶、大肠杆菌连接酶只能连接只能连接粘性末端粘性末端。B、T4噬菌体的连接酶噬菌体的连接酶不但能连接不但能连接粘性末端粘性末端， 还能连接还能连接齐平末端齐平末端。（1）两种连接酶连接特点。）两种连接酶连接特点。DNA连接酶：连接酶：46A、必须是两条、必须是两条双链双链DNA。B、DNA 3 端有游离的端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（端有一个磷酸基团（P）。）。C、需要、需要能量能量动物或噬菌体中：动物或噬菌体中：

33、ATP 大肠杆菌中：大肠杆菌中： NAD+（2）连接条件）连接条件47 效率：粘性末端效率：粘性末端 平端平端(100倍倍)； 5，突出突出 3，突出；突出； 平端：平端：HaeIII AluI HinCII SmaIA、连接所用的目的、连接所用的目的片段的状态：片段的状态：（3）影响连接效果的因素：）影响连接效果的因素：48 ATP：反复冻熔，：反复冻熔，ATP活性降低，活性降低，ATP溶解溶解 度不高，连接度不高，连接缓冲液宜分装；缓冲液宜分装； 单价离子：单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果；，提高连接效果； PEG：5%以下可以提高连接效率以下可以提高连接效率 连接效果

34、最好在连接效果最好在37 ，但形成的互补不稳定，但形成的互补不稳定; 最佳连接温度：最佳连接温度：12-16 ，较好的连接效果，互补又较稳定，较好的连接效果，互补又较稳定;B、连接、连接温度：温度：C、反应液中的成分：反应液中的成分：49 目的或作用：目的或作用：D、插入片段与载体的浓度比例、插入片段与载体的浓度比例 载体载体DNA与外源与外源DNA的分子摩尔比通的分子摩尔比通 常为常为13左右，甚至左右，甚至110 或更高或更高。增加插入片段与载体的接触机会，减增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。少载体自我连接的现象。50 依赖依赖DNA的聚合酶：的聚合酶： DNA聚合酶聚

35、合酶 I 依赖依赖RNA的的DNA聚合酶：逆转录酶聚合酶：逆转录酶 不依赖不依赖DNA的聚合酶：末端转移酶的聚合酶：末端转移酶3、DNA聚合酶（聚合酶（Polymerase）（1）DNA聚合酶类型：聚合酶类型：51（2）基因工程中常用的）基因工程中常用的DNA聚合酶聚合酶A、大肠杆菌、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 B、Klenow fragment C、T7 DNA聚合酶聚合酶 D、T4 DNA聚合酶聚合酶 E、修饰过的、修饰过的T7 DNA聚合酶聚合酶 F、逆转录酶、逆转录酶G、Taq DNA聚合酶聚合酶52 基本性质：基本性质： 53的的DNA聚合酶活性；聚合酶活性； 53的核酸外切酶活性；

36、的核酸外切酶活性； 35的核酸外切酶活性。的核酸外切酶活性。A、大肠杆菌、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I（ DNA pol I ）53 Klenow酶的来源：酶的来源： 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三端三分之二的大肽段，即为分之二的大肽段，即为Klenow酶。酶。 Klenow酶的基本性质：酶的基本性质： 53的的DNA聚合酶活性聚合酶活性 35的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性B、大肠杆菌、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I 大片段（大片段（ Klenow ）54C、T4、T7-DNA聚合酶聚合酶基本特性：基本特性： 均具有均具有53的的

37、DNA聚合酶活性，聚合酶活性， 35的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性 T4聚合酶聚合酶35的核酸外切酶活性强，的核酸外切酶活性强， 而而T7聚合酶聚合酶53的的DNA聚合酶活性聚合酶活性55 依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶，最主要用途以聚合酶，最主要用途以mRNA为模板合为模板合成成cDNA3AAAAAAAAAAAA5TTTTTTTTTTTTT5mRNA3cDNA3AAAAAAAAAAAA5TTTTTTTTTTT5mRNAoligo(dT)12-18反转录酶反转录酶Mg2+ dNTPD、反转录酶、反转录酶56E、Taq DNA聚合酶聚合酶 特点：特点： 分离自水生栖热菌，分子量为分离自水生

38、栖热菌，分子量为94,000，最适反，最适反应温度应温度75， 对对95高温具良好稳定性，该酶不高温具良好稳定性，该酶不存在存在35外切酶活性。外切酶活性。 用途：用途： 主要用于主要用于DNA的体外扩增的体外扩增（聚合酶链式反应）（聚合酶链式反应）57（3）DNA聚合酶的用途：聚合酶的用途：DNA片断片断探针的标记探针的标记DNA分子的分子的体外合成体外合成DNA分子的分子的体外突变体外突变DNA分子的分子的序列分析序列分析DNA分子的修复分子的修复聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）584、其它修饰酶、其它修饰酶l l 碱性磷酸酶碱性磷酸酶：功能为：功能为去除去除DNA或或RNA5末端

39、的磷酸末端的磷酸反反应，包括：应，包括： 来自小牛胸腺的碱性磷酸酶（来自小牛胸腺的碱性磷酸酶（CIP） 来自大肠杆菌的碱性磷酸酶（来自大肠杆菌的碱性磷酸酶（BAP）l l 磷酸激酶磷酸激酶： 在在DNA、RNA的的5-OH上加磷酸上加磷酸，常用于探针标记，常用于探针标记l l 其它酶：核酸外切酶其它酶：核酸外切酶III、 VII、 S1核酸酶、核酸酶、RNaseA、 DNase59二、常用的载体二、常用的载体（一）常用的克隆载体（一）常用的克隆载体60功功能：能：n运送外源基因高效转入受体细胞；运送外源基因高效转入受体细胞；n为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因提供复制能力或整合能力；

40、n为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。61 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性可转移性）；）； 具有合适的具有合适的筛选标记筛选标记； 具有较高的外源具有较高的外源DNA的的载装能力载装能力； 具有多克隆位点具有多克隆位点（MCS）； 具有与特定受体细胞相适应的具有与特定受体细胞相适应的复制位点复制位点或整合位点。或整合位点。克隆载体应具备的条件：克隆载体应具备的条件：62 基因工程中常用的载体基因工程中常用的载体(vector)主要包括主要包括质质粒粒(plasmid)、噬菌体、噬菌体(phage)和病毒和病毒

41、(virus)三大类。三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。单一的限制酶切点等。 631、质粒（、质粒（plasmid）（1）质粒的自主复制性质）质粒的自主复制性质 质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行复制系统进行 自主复制。自主复制。 严紧型：严紧型：1 - 3 拷贝拷贝 松弛型：几十个拷贝松弛型：几十个拷贝-数千个拷贝数千个拷贝 是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的是存在于天然细菌体内的一种独立于

42、细菌染色体之外的双链环状双链环状DNA，具有，具有独立复制独立复制的能力，通常带有细菌的的能力，通常带有细菌的抗药抗药基因。基因。64（2）质粒的不相容性）质粒的不相容性 定义：定义： 任何两种含有任何两种含有相似复制子结构相似复制子结构的不同质粒，不能同时存的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。 分子机理：分子机理： 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制同时两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制同时受到受到同一种拷贝数控制系统的干扰同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数致使两种质粒的最终拷贝数不同不同

43、，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。势。65（3）质粒的可转移性，如）质粒的可转移性，如F、Col、R质粒等；质粒等；（4）携带特殊的遗传标记：）携带特殊的遗传标记： 物质抗性：如抗生素、重金属离子物质抗性：如抗生素、重金属离子 物质合成：如细菌毒素、有机碱物质合成：如细菌毒素、有机碱66抗生素基因：抗生素基因：bla or ampr: 抗氨苄青霉素抗氨苄青霉素cat or amlr: 抗绿霉素抗绿霉素kan or kanr: 抗卡那霉素抗卡那霉素str or strr: 抗链霉素抗链霉素tet or tetr: 抗四环素抗四环素6

44、7682、噬菌体载体（、噬菌体载体（bacterium phage） 噬菌体噬菌体-细菌病毒，由核酸和蛋白质外壳组成；细菌病毒，由核酸和蛋白质外壳组成； 噬菌体类型：温和型和烈性两种噬菌体类型：温和型和烈性两种69（1） 噬菌体载体噬菌体载体n属温和型噬菌体；属温和型噬菌体；n具有具有COS黏性末端；黏性末端；n类型分为：替换型和插入型；类型分为：替换型和插入型； 替换型载体替换型载体-可插入可插入12-25 KB的片段；的片段； 插入型载体插入型载体-可克隆小于可克隆小于10 KB的片段的片段70（2）柯斯质粒）柯斯质粒 （Cosmid）n是一种是一种带有黏性末端位点带有黏性末端位点的的质粒

45、质粒n构建：构建：是一种以是一种以 噬菌体为基础为克隆大片段而设噬菌体为基础为克隆大片段而设计并和质粒共同构建的杂合载体，计并和质粒共同构建的杂合载体，具有噬菌体的具有噬菌体的COS位点位点和和质粒的复制子质粒的复制子，具有噬菌体和质粒的，具有噬菌体和质粒的双重特征。双重特征。7172柯斯质粒载体的特征：柯斯质粒载体的特征：1、具有、具有 噬菌体的特点噬菌体的特点: 具有具有COS位点位点-体外包装成噬菌体颗粒环体外包装成噬菌体颗粒环 化，不形成噬菌斑化，不形成噬菌斑2、具有质粒载体的特点、具有质粒载体的特点:在寄主内复制和具抗在寄主内复制和具抗 生素抗性基因。生素抗性基因。3、克隆能力强：、

46、克隆能力强：35-45 KB73类型类型nBAC： bacterial artificial chromosomes ，细菌人，细菌人工染色体工染色体nYAC： yeast artificial chromosome，酵母人工染，酵母人工染色体色体nTAC：transfer artificial chromosome,可转化人工可转化人工染色体染色体3、人工染色体、人工染色体74 oriS基因和基因和 repE基因是载体复制所必需基因是载体复制所必需（二）表达载体（二）表达载体1、真核基因导入大肠杆菌所用的、真核基因导入大肠杆菌所用的载体载体2、真核基因导入大肠杆菌的具体、真核基因导入大肠杆菌

47、的具体方式方式3、影响真核基因导入大肠杆菌的、影响真核基因导入大肠杆菌的因素因素751、真核基因导入大肠杆菌所用的载体、真核基因导入大肠杆菌所用的载体（1）pBV220（2）pET76pBV220侯云德侯云德 分子病毒学家分子病毒学家 中国工程院院士中国工程院院士1、分离了我国副流感病毒、分离了我国副流感病毒、型；型； 2、研制出包括、研制出包括1b、2a、2b、等亚型等亚型 的基因工程干扰素系列产品；的基因工程干扰素系列产品；3、成功组建原核高效表达载体、成功组建原核高效表达载体pBV220 系列系列及及pBV320系列系列通用型高效表达通用型高效表达 载体载体 。77（1）pBV220 已

48、经成功用于表达已经成功用于表达IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、LFNa、IFNr、TNF、G-CSF、GM-CSF等多种细胞因子。等多种细胞因子。 A 结构结构 B 优点优点78A 结构结构 pBV220共共3665 bp，共由，共由6个部份组成：个部份组成：（1）pUC18的的MCS；（2）核糖体）核糖体rrnB终止信号；终止信号；（3）pBR322的第的第4252-3735位；位；（4）pUC18的第的第2066-680位；位；（5）噬菌体噬菌体cIts抑制基因抑制基因 + PR启动子；启动子；（6）pRC-23的的PL启动子启动子 + SD序列序列。79A1）DNA复制

49、及重组载体的选择系统复制及重组载体的选择系统nori：复制起始点；复制起始点；pMB1，Col E1，pSC101；n选择标记：抗生素抗性基因选择标记：抗生素抗性基因，氨苄青霉素、四环素、氯，氨苄青霉素、四环素、氯霉素、链霉素等。霉素、链霉素等。80A2）外源目的基因的转录系统）外源目的基因的转录系统nPR：启动子启动子1；PL：启动子启动子2；n 抑制物基因：抑制物基因： clts857：抑制子基因抑制子基因，在，在31时，其基时，其基因产物具有因产物具有阻抑阻抑PL活性，当温度升高时，这种阻抑活活性，当温度升高时，这种阻抑活性就丧失，性就丧失，PL开始指导合成开始指导合成mRNA；n 转录

50、终止子：转录终止子：一段终止一段终止RNA聚合酶转录的聚合酶转录的DNA序列。序列。81A3）蛋白质的翻译系统）蛋白质的翻译系统n核糖体结合位点（核糖体结合位点（RBS）：ATG + SD sequencen 翻译翻译起始密码子：起始密码子：AUG （ATG）n 翻译终止密码子：翻译终止密码子：UAA、UAG、UGA82B 优点优点（1）可转化任何菌株可转化任何菌株（2）能）能防止出现防止出现“通读通读”现象现象（3）质粒分子量很小，有利于）质粒分子量很小，有利于增加其拷贝数量增加其拷贝数量（4）能插入大片段的外源基因能插入大片段的外源基因83（2）pET pET被认为是最有潜力的系统，来源于

51、被认为是最有潜力的系统，来源于T7 噬菌体噬菌体。A 克隆宿主克隆宿主可用大肠杆菌可用大肠杆菌K12的的HB101、JM103等细胞。等细胞。pET克隆到宿主体内之后，不会造成宿主的细胞损伤。克隆到宿主体内之后，不会造成宿主的细胞损伤。B 表达受宿主细胞的表达受宿主细胞的T7 RNA聚合酶控制。聚合酶控制。表达宿主表达宿主为为BL21、DE30。表达菌在表达菌在LB培养基、或在培养基、或在M9培养基中培养基中生长良好。生长良好。C 表达产物可以用金属络合物的方式进行分离，能够达到表达产物可以用金属络合物的方式进行分离，能够达到高纯度、高收率。高纯度、高收率。84MCSpET32 a(+)以以T

52、7lac作为作为启动子；启动子；pET32 a(+) 还带有还带有T7 .Tag和和His-Tag融合标融合标签签，此类标签可用于检，此类标签可用于检测和纯化相关目的蛋白；测和纯化相关目的蛋白； pET32a(+) 上与目的基上与目的基因共表达的因共表达的硫氧还蛋白硫氧还蛋白可以促进二硫键形成，可以促进二硫键形成，增加目的蛋白可溶性，增加目的蛋白可溶性，便于分离纯化。便于分离纯化。 852、真核基因导入大肠杆菌具体方式、真核基因导入大肠杆菌具体方式共有共有3种种方式方式（1）融合蛋白）融合蛋白（2）非融合蛋白）非融合蛋白（3）分泌型表达蛋白）分泌型表达蛋白86目的基因在原核细胞中的表达形式目的

53、基因在原核细胞中的表达形式n包涵包涵体：体：外源基因的高效表达产物在原核细胞中积累，并外源基因的高效表达产物在原核细胞中积累，并致密的聚集在一起形成的水不溶性蛋白质结构。具有正确致密的聚集在一起形成的水不溶性蛋白质结构。具有正确的氨基酸序列，但空间构象错误，一般没有生物学活性。的氨基酸序列，但空间构象错误，一般没有生物学活性。n n 分泌型外源分泌型外源蛋白：蛋白：外源基因的表达产物通过运输或分泌外源基因的表达产物通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋白。白。87（1）融合蛋白）融合蛋白A 定义定义B 优缺点优缺点C

54、改进措施改进措施D 融合蛋白的具体表达方式融合蛋白的具体表达方式8889A 定义定义 是指产生的蛋白质同时含有是指产生的蛋白质同时含有细菌蛋白细菌蛋白+目的目的蛋白蛋白。融合蛋白的融合蛋白的氨基氨基端由大肠杆菌端由大肠杆菌原核基因原核基因编码编码、而、而羧基端羧基端则由则由真核基因编码真核基因编码。 最终表达出来的蛋白质最终表达出来的蛋白质= 1条原核多肽条原核多肽 + 1条真核条真核多肽多肽，称为，称为融合蛋白融合蛋白。 90B 优缺点优缺点优点：优点：（1）蛋白质在细菌体内比较）蛋白质在细菌体内比较稳定稳定，不易被细菌的酶类不易被细菌的酶类所降解，所降解，（2）容易实现）容易实现高效表达，

55、高效表达，（3）基因操作简便。）基因操作简便。缺点：缺点： 由于蛋白质中含有细菌蛋白，会影响真核蛋白由于蛋白质中含有细菌蛋白，会影响真核蛋白的的免疫原性免疫原性，只能用作抗原，只能用作抗原,不能作为人体注射用药。不能作为人体注射用药。91C 改进措施改进措施（1）在细菌蛋白和目的蛋白间加入）在细菌蛋白和目的蛋白间加入Ile-Glu-Gly-Arg，可被可被人体内的人体内的凝血因子凝血因子X识别而切开。在体外，采用特异的识别而切开。在体外，采用特异的蛋白酶（凝血因子蛋白酶（凝血因子X、胶原酶、肠激肽酶）对融合蛋白、胶原酶、肠激肽酶）对融合蛋白进行降解。进行降解。（2）在细菌蛋白和目的蛋白间加入）

56、在细菌蛋白和目的蛋白间加入Met，CNBr可专一性识可专一性识别别Met并并切开切开，形成原核多肽，形成原核多肽 + 真核蛋白质分子，从而真核蛋白质分子，从而获得具有生物活性的天然真核蛋白质分子。获得具有生物活性的天然真核蛋白质分子。92D 融合蛋白的具体表达方式融合蛋白的具体表达方式 融合基因融合基因-融合蛋白融合蛋白 基因结构为基因结构为“原核启动子原核启动子原核原核SD序列序列原核结构基因原核结构基因片段片段真核结构基因序列真核结构基因序列原核终止密码子原核终止密码子”（D1）融合表达载体的构建融合表达载体的构建（D2）常用的融合蛋白（原核细菌表达的蛋白质）常用的融合蛋白（原核细菌表达的

57、蛋白质）（D3）融合蛋白的融合蛋白的切除方法切除方法93关键：关键：v 融合蛋白与外源蛋白的融合蛋白与外源蛋白的阅读框阅读框要对齐要对齐v 两个蛋白的结合位点的设计很重要，应便于下一步切除融两个蛋白的结合位点的设计很重要，应便于下一步切除融合蛋白的操作。合蛋白的操作。（D1）融合表达载体的构建融合表达载体的构建94（D2）常用的融合蛋白（原核细菌表达蛋白质）常用的融合蛋白（原核细菌表达蛋白质）95（D3）受体蛋白的受体蛋白的切除方法切除方法v化学断裂法：化学断裂法：溴化氰溴化氰（CNBr）-Met-（切点）（切点）-AAv酶促断裂法：酶促断裂法：凝血因子凝血因子Xa，有蛋白酶活性，识别序有蛋白

58、酶活性，识别序列列:IleGluGlyArg-（切点）（切点）-AA96（2）非融合蛋白）非融合蛋白A 定义定义B 优缺点优缺点C 具体表达方式具体表达方式97A 定义定义 非融合蛋白表达非融合蛋白表达方式是指工程菌大肠杆菌进行蛋白方式是指工程菌大肠杆菌进行蛋白质质翻译时翻译时，是以，是以真核生物真核生物的的mRNA的的AUG为为翻译起始点翻译起始点，最后表达出的蛋白质中最后表达出的蛋白质中不含细菌蛋白不含细菌蛋白。 非融合蛋白表达方式也称为非融合蛋白表达方式也称为包涵体型外源蛋白的表包涵体型外源蛋白的表达达。98B 优缺点优缺点 优点优点: 非融合蛋白能够较好地保持真核蛋白质的非融合蛋白能够

59、较好地保持真核蛋白质的生物活性。生物活性。 缺点：缺点：（1）容易被细菌体内的）容易被细菌体内的蛋白酶所破坏，蛋白酶所破坏，（2）非融合蛋白的）非融合蛋白的氨基端氨基端常常带有常常带有甲硫氨酸甲硫氨酸，在人体内用药，在人体内用药时常常引起人体的时常常引起人体的免疫反应。免疫反应。99C 非融合蛋白的具体表达方式非融合蛋白的具体表达方式非融合蛋白表达方式可分为非融合蛋白表达方式可分为2种种: （C1）非融合基因）非融合基因非融合蛋白非融合蛋白 （C2）融合基因）融合基因非融合蛋白非融合蛋白100（C1）非融合基因）非融合基因非融合蛋白非融合蛋白 基因结构为基因结构为“原核启动子原核启动子原核原核

60、SD序列序列ATG真核结真核结构基因序列构基因序列原核终止密码子原核终止密码子” 要求要求1：SD序列和序列和ATG之间的距离要合适，相差之间的距离要合适，相差2-3个碱个碱基，其表达效率就大受影响。基，其表达效率就大受影响。 要求要求2： ATG和真核结构基因序列之间必须加接人工接和真核结构基因序列之间必须加接人工接头，以保证头，以保证ATG之后的真核基因不发生通读框架的改变。之后的真核基因不发生通读框架的改变。101（C2）融合基因）融合基因非融合蛋白非融合蛋白 基因结构为基因结构为“原核启动子原核启动子原核原核SD序列序列原核原核ATGTGATG（真核基因起始结构）（真核基因起始结构）真