酶法分析(生科院2015)

1、4.反应产物抑制反应产物抑制SPS P 酶 尿 酸 的 定 量尿 酸H2OO2尿 酸 酶尿 囊 酶 C O2H2O22293nmor297n m有 特 征 吸 收通 过 测A 293orA 297定 量A = A 1A 2-A 3+方 法 ： 取 试 管 3支酶 对 照底 物 对 照反 应尿 酸 酶 溶 液硼 酸 B uff尿 酸 酶 溶 液硼 酸 B uff待 测 样 品 液 待 测 样 品 液123室 温 放 15m inA 1A 2A 3羟基丙酮酸定量可用两种酶：甘油酸脱氢酶（专一性强）乳酸脱氢酶（丙酮酸干扰）羟基丙酮酸甘油酸脱氢酶NADH+H+NAD+D-甘油酸羟基丙酮酸乳酸脱氢酶NA

2、DH+H+NAD+L-甘油酸方法：羟基丙酮酸NADH+H+A1加入酶充分反应后A2比色皿中反应测定AA1A2A340加酶A时间（分）羟基丙酮酸定量羟基丙酮酸定量可用两种酶：可用两种酶：甘油酸脱氢酶甘油酸脱氢酶（专一性强）（专一性强） 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶（丙酮酸干扰）（丙酮酸干扰）例 2L-谷 氨 酸+H2O谷氨酸脱氢酶NAD+NADH-酮 戊 二 酸+NH4+此 反 应 平 衡 偏 向 左 方 .测 定 时 需 设 法 使 反 应 平 衡 向 右 进 行克 服 的 办 法 :的 定 量 测 定 (NADH生 成 量 的 测 定 )用 谷 氨 酸 脱 氢 酶L-谷 氨 酸+加 肼 ,反 应 生

3、 成-酮 戊 二 酸 可 以 和 肼 反 应生 成 腙 ,将 生 成 物 -酮 戊 二 酸除 去 .提 高 NAD+的 浓 度可 偶 联 心 肌 黄 酶方 法 :123空 白 管+NAD(过 量 )谷 氨 酸酶肼+NAD(过 量 )谷 氨 酸肼加 NAD后 准 确 60分 钟测 340nm吸 附 值加 NAD后 准 确 60分 钟测 340nm吸 附 值A1A2A=A2-A1根 据 NADH的 吸 附 系 数 求 得 其 量 ,即 可 求 得 L-谷 氨 酸 的 量( 二 ） 和 指 示 酶 反 应 偶 联 的 定 量 法常 用 在 下 面 两 种 情 况（ 1 ）SE测指E PBP 1P 2

4、（ 2 ） 所 用 酶 的 专 一 性 不 高SASBSCE测指E S 与 P 无 法 区 分PAPBPC常用在下面两种情况常用在下面两种情况指 示 酶 反 应1 .以 脱 氢 酶 为 指 示 剂测 定 酶 反 应 ： SEP 1测 定 酶 反 应 的 产 物 P 1 作 为 以 N A D 或 N A D P 为辅 酶 的 某 一 脱 氢 酶 的 底 物 ， 将 两 个 酶 促 反 应相 偶 联 。指 示 酶 反 应 ：P 1P 2N A DN A D PN A D HN A D P H指示酶反应指示酶反应1.以脱氢酶为指示剂以脱氢酶为指示剂葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）定量G-1-PG-6

5、-P变位酶脱氢酶NADP+NADPH+H+G-6-P6GA测定酶反应：指示酶反应：P方法：BuffNADP样品（G-1-P）脱氢酶放5分钟340nm测A1（清除试剂及样品中混入的G-6-P）向混合液中加变位酶放4分钟340nm测A2A2A1 代表了G G-1-P例1的量A2-A1代表了代表了G-1-P的量的量例 2样 品 中 同 时 含 有 G 和 果 糖 ,利 用 酶 法 分 析 测 定 G 的 量(利 用 己 糖 激 酶 )己 糖 激 酶GA T PG -6-P果 糖 -6-P果 糖己 糖 激 酶葡 萄 糖 异 构 酶指 示 反 应 :脱 氢 酶6G AN A D P+N A D P HA

6、 T PPG -6-P()G -6-PG -6-PP例2 样品中同时含有样品中同时含有G和果糖，利用酶法分析和果糖，利用酶法分析 测定测定G的量（利用己糖激酶的量（利用己糖激酶）方 法 : B uff+N A D P +样 品 (G ,果 糖 )+G -6-P 脱 氢 酶放 置 一 定 时 间测 定 A 1向 混 合 液 中 加 入 己 糖 激 酶测 定 A 2通 过 A 2-A 1可 计 算 出 G 的 量(若 需 测 定 果 糖 的 量 可 继 续 向 下 )向 混 合 液 中 加 入 葡 萄 糖 异 构 酶测 定 A 3通 过 A 3-A 2可 计 算 出 果 糖 的 量P放 置 一 定

7、 时 间放 置 一 定 时 间例例3在一个比色杯中同时定量丙酮酸，磷酸在一个比色杯中同时定量丙酮酸，磷酸烯醇式丙酮酸和烯醇式丙酮酸和D-2-磷酸甘油酸磷酸甘油酸例 3在 一 个 比 色 杯 中 同 时 定 量 丙 酮 酸 ,磷 酸 烯 醇 式 丙 酮酸 和 D -2-磷 酸 甘 油 酸测 定 :偶 联 :指 示 :D -2-磷 酸 甘 油 酸(D -2P G A )烯 醇 化 酶磷 酸 烯 醇 或 丙 酮 酸 (P E P )磷 酸 烯 醇 或 丙 酮 酸 + A D P丙 酮 酸 激 酶丙 酮 酸 + A D P丙 酮 酸乳 酸 脱 氢 酶N A D H + H+N A D+乳 酸2.以 脱

8、 氢 酶 以 外 的 酶 作 为 指 示 剂过 氧 化 物 酶 作 为 指 示 剂H2O2 4-氨 基 安 替 比 林 酚过 氧 化 物 酶有 色 化 合 物（ 醌 亚 胶 色 素 ）270 420nm测 定 G的 量测 定 酶 反 应 G H2O O2G氧 化 酶GAH2O2（ 葡 萄 糖 醛 酸 ）指 示 酶 反 应有 色 物通 过 测 定 270 420nm 任 一 处 的 A的 变 化 可 定 出 G的 量+H2O2 4-氨 基 安 替 比 林 酚过 氧 化 物 酶2.以脱氢酶以外的酶作为指示剂以脱氢酶以外的酶作为指示剂过氧化物酶作为指示剂过氧化物酶作为指示剂492nm有强吸收有强吸收

9、例：例：L-谷氨酸的定量测定谷氨酸的定量测定测定反应：测定反应：L-Glu + NAD + H2O 谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶+-酮戊二酸酮戊二酸+ NADH + H+指示反应：指示反应：NADH + INT + H心肌黄酶心肌黄酶NAD + 甲臜甲臜 +NAD + 甲臜甲臜 心肌黄酶心肌黄酶+酶循环放大法的原理、步骤（超微量前列腺素的定量为例）（三步）第一步：转换反应：PGNAD+PG脱氢酶1、5- 脱羧- PGNADHH+NADH转NADH转PG可作循环底物第二步：循环反应- 酮戊二酸Gl u脱氢酶Gl uNADH+H+NAD+3-甘油酸甘油醛脱氢酶甘油醛NADH转Gl u( 或3-甘油酸）

10、n次循环nP3-P3-PP正比酶循环放大法的原理、步骤酶循环放大法的原理、步骤（超微量前列腺素的定量为例）（超微量前列腺素的定量为例）（三步）第一步：转换反应（三步）第一步：转换反应酶循环放大法的原理、步骤（超微量前列腺素的定量为例）（三步）第一步：转换反应：P G N A D+P G 脱氢酶1 、5 - 脱羧 - P G N A D H H+N A D H转N A D H转P G可作循环底物第二步：循环反应 - 酮戊二酸G l u 脱氢酶G l uN A D H + H +N A D +3 -甘油酸甘油醛脱氢酶甘油醛N A D H 转G l u ( 或3 -甘油酸）n 次循环nP3 -P3

11、-PP正比第二步：循环反应第二步：循环反应第三步：指示反应：利用终点法测第三步：指示反应：利用终点法测Glu（或（或3磷酸甘油酸）的量磷酸甘油酸）的量如何测得循环数如何测得循环数n？ 用已知量的用已知量的NADH已知已知作为作为NADH转转在相同条在相同条件下进行循环反应和指示反应件下进行循环反应和指示反应NADH已知已知=NADH指示指示/n n=NADH指示指示/NADH已知已知（即用已知量的（即用已知量的NADH已知已知平行做循环反应，指平行做循环反应，指示反应）示反应）在这种方法中应注意的几个问题：在这种方法中应注意的几个问题：1.在进行循环反应之前，必须在进行循环反应之前，必须设法除

12、去转换反应中剩余的辅酶设法除去转换反应中剩余的辅酶，在上例，在上例中就是设法除去中就是设法除去NAD+除去的方式：除去的方式：NAD和和NADP的氧化型和还原型在不同的的氧化型和还原型在不同的pH值下其稳定值下其稳定性不同，可通过调节性不同，可通过调节pH来达到目的来达到目的 NAD+ NADP+ (氧化型氧化型) NADH NADPH(还原型还原型)pH2 （25） 1h稳定稳定 5min99.9%被破坏被破坏pH13（60 ） 10min99.9%被破坏被破坏 1001h 仍稳定仍稳定 在这种方法中应注意的几个问题：1 、在进行循环反应之前，必须设法除去转换反应中剩余的辅酶，在上面的例子中

13、就是设法除去N A D+除去的方式：N A D 和N A D P 的氧化型和还原型在不同的P H 值下其稳定性不同，可通过调节P H 来达到目的N A D+ N A D P+（氧化型）N A D H N A D P H （还原型）P H 2 （2 5 摄氏度）P H 1 3 （6 0 摄氏度）1 小时稳定5 m i n 9 9 . 9 %被破坏1 0 分钟9 9 . 9 %被破坏1 0 0 1 小时仍稳定2 、在循环反应中，底物（不是辅酶）需够量循环反应：P bS bABS aP a S a K S b Km E am E b3 、要用已知量的循环底物（上例中N A D H ）平行做循环反应和

14、指示反应以求得循环数n2.在循环反应在循环反应中中，底物（不是辅酶）需够量底物（不是辅酶）需够量3.要用要用已知量的循环底物已知量的循环底物（上例中（上例中NADH）平行做循环反）平行做循环反应和指示反应以求得循环数应和指示反应以求得循环数n循环反应SaPaEaEbABPbSbABEaEbSaSbPaPbNAD+醇脱氢酶（ADH）苹果酸脱氢酶（MDH）乙醇草酰乙酸乙醛苹果酸NADH6G脱氢酶（G6PDH）谷氨酸脱氢酶（GDH）6G谷氨酸NADP+NADPHPP-酮戊二酸6GPACoASHCH3COCoA转乙酰基酶（PTA）柠檬酸合成酶（CS）乙酰磷酸草酰乙酸磷酸柠檬酸P单酶循环1、CoA循环：

15、丙二酸丙二酸脱羧酶（MD）乙酰CoA丙二酰CoA乙酸CO2MD+2、NAD循环：脱氢表雄酮3，17B羟-固醇脱氢酶雄烯-3-17-二酮NADHNAD3，17B羟-固醇脱氢酶睾酮5-+单酶循环单酶循环（ 二 ） 应 用 范 围1 、 有 循 环 底 物 参 加 的 酶 反 应 的 底 物 或 酶 可 测 定N A D 、 N A D P 、 C o A 等2 、 能 与 以 上 反 应 偶 联 的 酶 反 应 的 底 物 或 酶 可 测 定如 ：G + A T PG - 6 - P + A D PG - 6 - PG 6 P D HN A D P+N A D P HG 醛 酸 - 6 - P己 糖 激 酶 （ H K ）+ H+可 测 G 、 可 测 A T P 、 也 可 测 H K（二）应用范围（二）应用范围1.有循环底物参加的酶反应的底物或酶可有循环底物参加的酶反应的底物或酶可测定测定NAD、NADP、CoA等等2. 能与以上反应偶联的酶反应的底物或酶能与以上反应偶联的酶反应的底物或酶 可测定可测定辅酶的测定 （2、3-DPG）定量3-P甘油酸P P P P P甘油酸变位酶2、3-二 P 甘油酸2- P 甘油酸FMN（黄素嘌呤单核苷酸）FAD（黄素嘌呤二核苷酸）TPP（焦磷酸硫胺）乳酸氧化酶氨基酸氧化酶丙酮酸脱羟酶P P