纳米肿瘤疫苗的制备工艺的优化及特性鉴定

1、纳米肿瘤疫苗的制备工艺的优化及特性鉴定         11-01-31 10:23:00     作者：李侠    编辑：studa20【摘要】  目的: 制备无明显毒性、 高效的恶性肿瘤基因工程纳米疫苗。方法: 纯化融合蛋白MH, 薄膜分散超声法制备包裹MH的纳米脂质体肿瘤疫苗NL（MH）, 并评价其粒径、 包裹率及稳定性; 观察NL（MH）免疫组小鼠的急性毒性反应, 及重要脏器的病理学改变。结果: 成功制备出粒径为（80

2、±250） nm的纳米脂质体, 其药物包裹率为30%, 于4放置6个月后或3 000 r/min 10 min离心后无分层, 证明其稳定性良好; 与PBS对照组相比, 免疫组小鼠未见明显毒性反应。结论: 该恶性肿瘤基因工程纳米疫苗具有良好的理化性质, 未见毒性反应。 【关键词】  肿瘤特异性抗原 脂质体 树突状细胞 肿瘤疫苗肿瘤疫苗能诱导特异性的抗肿瘤免疫反应,  在肿瘤防治上已经显示出一定的效果,  被认为是最具前景的肿瘤治疗方法。本实验室运用MAGE3/Hsp70的融合蛋白免疫小鼠,  结果显示融合蛋白诱导机体产生高效的MAGE3特异性CT

3、L,  对表达MAGE3的B16细胞有很好的杀伤效果1。为了使该融合蛋白能更好地被机体摄取且更好地靶向肿瘤组织,  更有效地激活机体产生针对MAGE3的特异性CTL,  对表达MAGE3的肿瘤细胞具有更强的杀伤作用,  本部分实验中采用纳米脂质体为载体,  包裹MAGE3/Hsp70的融合蛋白（MH）制备恶性肿瘤基因工程纳米疫苗。1  材料和方法1.1  材料 分光光度计（UV3000型）为日本岛津公司产品; 透射电子显微镜（JEM2000 EX型）为日立公司产品;    集热式恒温加

4、热磁力搅拌器（DF101B型）为巩义市予华仪器有限责任公司产品; 20 kHz/500 watt超声粉碎仪为美国ColeParmer公司产品; RPMIl640培养基购自美国Gibco公司; 蛋黄卵磷脂和胆固醇为德国Merck公司产品; 其他试剂均为进口超纯级或国产分析纯级; pET28（+）MAGE3/Hsp70质粒由本实验室研制。1.2  方法PAGE。采用80 V,  60 min转移PVDF膜,  50 g/L脱脂乳TTBS室温下封闭PVDF膜60 min,  用TTBS 1500稀释MAGE3抗血清,  从封闭液中取出膜, 

5、 放入抗血清中,  37  60 min。TTBS洗膜3次每次10 min,  采用TTBS缓冲液15 000稀释HRP标记的生物素化二抗,  37  60 min,  TTBS洗膜,  DAB显色。采用薄膜分散超声法制备纳米疫苗,  选用4因素、 3水平正交设计进行工艺优化见表1（4个因素分别为大豆卵磷脂和胆固醇摩尔比（A）、 脂和水体积比（B）、 超声时间（C）、 PBS的pH值（D）, 以包封率为考察指标来筛选处方）。脂质体具体制备步骤如下：秤取处方量的大豆卵磷脂和胆固醇于100 mL烧瓶中,  加

6、入氯仿12 mL,  置于6570 水浴中,  于旋转蒸发仪上旋转, 减压除去氯仿,  得到磷脂膜。另取溶有目的蛋白（1 g/L）的PBS（ pH=7.5±0.5）20 mL 于小烧杯中,  同置于6570 水浴中,  保温待用。取预热的PBS,  加至含有磷脂膜的烧瓶中,  6570水浴中搅拌水化1020 min,  即成脂质体液。取出该液于烧杯中,  置于磁力搅拌器上,  室温下搅拌3060 min。冰水浴条件下超声1020 min,  即得脂质体胶体液。0.1 

7、; m聚碳酸树脂纤维过滤3次,  整粒,  得粒径较均匀的脂质体。用0.22  m的滤膜过滤除菌后,  于4保存。表1  各个因素不同配比的正交设计（略）(1)形态观察: 将制成的NL（MH）500倍稀释于生理盐水中,  取100 L滴于400目铜网上,  1 min后吸去上清, 10 g/L磷钨酸负染色1 min,  自然晾干后在透射电子显微镜下观察其形态。将采集的图象经计算机图象分析,  求得NL（MH）的平均粒径。(2)包裹率及稳定性测定: 采用SephedexG100凝胶层析法,  洗脱

8、液为PBS,  流速为0.5 mL/min。取NL（MH）1.0 mL上柱,  收集游离峰即为游离的MH。同时制备不同浓度的MH标准蛋白样品,  Bradford法测定蛋白的含量,  计算出NL（MH）中游离MH的含量。将制备的NL（MH）置于4冰箱保存6个月后或3 000 r/min 10 min离心后,  电镜观察纳米脂质体形态,  明确其稳定性。包封率=（系统中的总药量 液体介质中未包封的药量）/系统中的总药量×100%。(3)纳米疫苗急性毒性: 实验取二级条件C57BL/6小鼠20只,  雌雄不拘,

9、0; 随机分为2组,  每组10只。PBS对照组：腹腔注射PBS 1.0 mL/鼠; 纳米疫苗（NL（MH）组）: 腹腔注射包封MH的最大浓度0.3 g/L的纳米疫苗,  1.0 mL/鼠,  观察实验鼠有无急性中毒表现,  并记录两周内死亡小鼠的只数。实验结束时处死动物、剖检（肉眼观察主要脏器的大小、 硬度、 有无胸腹腔积液等）、 取心脏、 肝脏、 脾脏、 肺脏、 肾脏,  用4 g/L的甲醛固定,  石蜡包埋,  HE染色,  行病理组织学观察。应用SPSS11.5统计软件进行数据分析,  P<0.05表示有统计学意义,  计量数据结果均以x±s表示。组间差异性比较采用oneway ANOVA。2  结果2.1  MAGE3/Hsp70融合蛋白的纯化与鉴定  含有pET28（+）MAGE3/Hsp70质粒的BL21(DE3),