实验四PCR技术在动物传染病诊断中的作用

1、实验四PCR技术在动物传染病诊断中的作用实验四-PCR技术在动物传染病诊断中的作用聚合酶链反应聚合酶链反应( (Polymerase chain reaction) )简称简称PCRPCR，是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促序列体外引物定向酶促扩增法扩增法，可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。n 模板模板DNA或或RNAn 特异性引物特异性引物: sense和和 antisensen Taq酶：耐热酶：耐热DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2+ n PCR缓冲液：缓冲液： 50mmol/L KC

2、l Mg2+乙酰乙酰BSAPCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分模板模板DNAMg2+dNTPTaq酶酶引物引物引物设计注意事项引物设计注意事项引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。 引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的避免在引物的33端使用碱基端使用碱基A A。另外，两条引物3端若互补，或者单条引物自身形成发夹结构也可能导致PCR反应失败。55端序列对端序列对PCRPCR影响不太大，因此常用来引

3、进修饰位点或标记物。影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。可在引物设计时加上限制酶位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。引物设计注意事项引物设计注意事项引物序列的引物序列的GCGC含量一般为含量一般为40-60%40-60%，过高或过低都不利于引发反应，因为GC含量决定了DNA双链的解链温度（Tm）。另外，上下游引物的GC含量不能相差太大。 G值是指dna双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低（绝对值不超过9），而5端

4、和中间G值相对较高的引物。引物的3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 引物的设计的总原则：扩增的效率和特异性引物的设计的总原则：扩增的效率和特异性 长度：1530bp 碱基尽可能随机分布（G+C含量 40-60%） 引物内部不能形成二级结构 两引物间没有互补链存在 3端一定要与模板严格配对 5端可引入突变，加酶切位点等辅助软件：primer5，Oligo，DNAsis等PCR反应体系反应体系引物引物操作界面操作界面X mol/L OD260/ A(1600

5、0)+C(70000)+G(1202X)+T(9600) X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。 PCR反应体系反应体系引物浓度计算引物浓度计算 一般一般PCRPCR反应中的引物终浓度为反应中的引物终浓度为。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低则降低产量。利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度，在1cm光程比色杯中，260nm下，引物浓度可按下式计算： dNTP应用NaOH 将pH调至，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5-10mM/L并分装，-20贮存。一般反应中每种一般反应中每种dNTPdNTP的终浓度为的终浓度为。当dNTP终浓度大于50m

6、M/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4 4种种dNTPdNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTPdNTP的的不足出现的错误掺入不足出现的错误掺入。 PCR反应体系反应体系 4种三磷酸脱氧核苷酸种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为。对于一种新的PCR反应，可以用的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓

7、度。在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度。PCR反应体系反应体系 Mg2+TITRATE YOUR Mg2+ CONCENTRATION! 4 3.5 3 1 mMNormally, 1.5mM MgCl2 is optimal Best supplied as separate tubeAlways vortex thawed MgCl2Mg2+ concentration will be affected by the amount of DNA, primers and nucleotid

8、es 就模板就模板DNADNA而言，影响而言，影响PCRPCR的主要因素是模板的数量和纯度。的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中的模板数量为102 -105个拷贝，对于单拷贝基因，这需要的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA。扩增多拷贝序列时，用量更少。模板量过多则可能增加非特异性产物。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。PCR反应体系反应体系模板模板 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能的主要功能是：是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而

9、溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶蛋白酶K能水解消化能水解消化蛋白质蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 PCR反应体系反应体系模板的提取方法模板的提取方法 TaqDNA聚合酶活性半衰期为92.

10、5 130min，95 40min， 97 5min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义为74下，30min，掺入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。TaqDNATaqDNA聚合酶的一个致命弱点是它的出聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般错率，一般PCRPCR中出错率为中出错率为2 2 1010-4-4 核苷酸核苷酸/ /每轮循环每轮循环，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意。在100l PCR反应中，单位的TaqDNA聚合酶就足以进行30轮循环。所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适

11、当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。降低。反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验，需要预先灭活TaqDNA聚合酶, 灭活灭活TaqDNATaqDNA聚合酶的方法有：聚合酶的方法有：PCR反应体系反应体系TaqDNA聚合酶聚合酶(1) PCR产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。(3) 99-100加热10min。目前已有直接纯化PCR产物的装备可用。PCR反应体系反应体系 TaqDNA聚合酶灭活方法聚合酶灭活方法 缓冲液一般含10-50mmol/L TrisCl (20下pH

12、8.3-8.8), 50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+ 。TrisCl在20时pH为，但在实际PCR反应中，pH为。50mmol/L的KClKCl有利于引物的退火有利于引物的退火。另外，反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇二硫苏糖醇(DDT)(DDT)或100g/ml的牛血清白蛋白牛血清白蛋白(BSA)(BSA)，它们可稳定酶活性，它们可稳定酶活性，另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利。各种TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。PCR反应体系反应体系 PCR反应缓冲液反应缓冲液PCRPCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性94延伸延伸72 退火退

13、火Tm-5包括三个基本步骤: 变性(使改变本性):目的双链DNA片段在94下解链; 退火(退火):两种寡核苷酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(1)延伸(延长): DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCRPCR的基本反应步骤的基本反应步骤在第一轮循环前，在94下变性5-10

14、min非常重要，它可使模板DNA完全解链，然后加入TaqDNA聚合酶(热启动热启动)，这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全，往往使PCR失败。因为未变性完全的DNA双链会很快复性，减少DNA产量。对于富含GC的序列，可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。 引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度。实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5。一般当引物中一般当引物中GCGC含量高，长度含量高，长度长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产

15、长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性越高物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并，只用两种温度(例如用60和94)完成整个扩增循环，既省时间又提高了特异性。 延伸反应通常为延伸反应通常为7272，接近于，接近于TaqDNATaqDNA聚合酶的最适反应温度聚合酶的最适反应温度7575。实际上，引物延伸在退火时即已开始，因为TaqDNA聚合酶的作用温度范围可从20-85。延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。在一般反应体系中，度。在一般反应体系中，TaqDNATaqDNA聚合酶每分钟约可合成聚合酶每分钟约可

16、合成2kb2kb长的长的DNADNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对很低浓度的目的序列，则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后，都需要一一般在扩增反应完成后，都需要一步较长时间步较长时间(10-30min)(10-30min)的延伸反应的延伸反应，以获得尽可能完整的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。 当其它参数确定之后，循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多，会使循环次数过多，会使PCRPCR产物中非特异性产物中非特异性产物大量增加。产物大量增加。通常经25-30轮循环扩增后，反应中TaqDNA聚合酶已经不足，如果此时产物量仍不

17、够，需要进一步扩增，可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板，重新加入各种反应底物进行扩增，这样经60轮循环后，扩增水平可达109-1010。 扩增产物的量可用下列公式表示:CC0 (1+P)n 。其中：C为扩增产物量，C0 为起始DNA量，P为扩增效率，n为循环次数。 在扩增后期，由于产物积累，使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明显上升，这称为平台效应平台效应。平台期会使原先由于平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非

18、特异性产物。扩增效率扩增效率55333355聚聚 合合 酶酶 链链 式式 反反 应应 示示 意意 图图目的片段目的片段模板模板引物对引物对高温变性高温变性低温退火低温退火中温延伸中温延伸不断循环不断循环5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 PCR PCR 基本工作原理基本工作原理Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。PCRPCR反应特点反应特点特异性

19、强特异性强引物与模板DNA特异正确的结合碱基配对原则TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性靶基因的特异性与保守性PCRPCR反应特点反应特点灵敏度高灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个PFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 PCRPCR反应特点反应特点对标本的纯度要

20、求低对标本的纯度要求低PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增仪上进行变性-退火-延伸反应，一般在24小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广 PCRPCR反应特点反应特点简单、快速简单、快速PCRPCR退火温度的确定退火温度的确定基因片段基因片段Gene segment 上下游引物序列上下游引物序列（53）Primer sequence（53) 起始位置起始位置Position 退火温度退火温度Tm值值扩增产物大小扩增产物大小（碱基）（碱基）Size（base pairs) F片段Forward, CAA CGA

21、CTG AAC CCC ATG CA 1 to 2252107bpReverse, ACC AAC ACT ACG TCT CCT TG 85to 107 55 10PCR Buffer5L上游引物(20M)1L下游引物(20M)1LcDNA4LMgCl2(25mM)3LdNTPs(各2.5mM)4LEx Taq(5U/L)0.5LddH2031.5LTotal V50LPCRPCR反应体系及反应条件反应体系及反应条件以上各成分混匀，瞬时离心。反应条件：94热变性5min；94变性1min；退火温度：每对引物的最低溶解温度降低05，40s；72延伸，延伸时间根据所扩增片段的长短，分别设置30s

22、2min。72最后延伸10min。3035循环10 PCR Buffer2.5L上游引物(20M)0.5L下游引物(20M)0.5LRNA2LRNasinMgCl2(15mM)0.32LLdNTPs(各2.5mM)2.5LEx Taq(5U/L)1LAMV RTaseDEPC处理H200.213.5LLTotal V25L一步法一步法RT-PCRRT-PCR反应体系及反应条件反应体系及反应条件以上各成分混匀，瞬时离心。反应条件：42 反转录45min;94热变性3min；94变性1min；退火温度：每对引物的最低溶解温度降低05，40s；72延伸，延伸时间根据所扩增片段的长短，分别设置30s2min。72最后延伸10min。3035循环扩增条件的优化扩增条件的优化 优化反应参数：退火温度和时间、变性温度和时间优化反应