肿瘤细胞培养技术

1、关于肿瘤细胞培养技术第一页，共49页幻灯片HistroyHistroy肿瘤类型：肿瘤类型：间充质间充质 上皮上皮 神经外胚层神经外胚层 造血源性造血源性（1955-1958-1963-1965）In vitro: 原代原代 传代传代 建系建系（1967-1970）配基成分：配基成分：纯血清纯血清 含血清含血清 无血清无血清生物学特性：生物学特性：细胞细胞 亚细胞亚细胞 酶和分子酶和分子 第二页，共49页幻灯片肿瘤细胞肿瘤细胞in vitroin vitro的特点的特点细胞保持永生性：细胞保持永生性：自我复制自我复制形态学：形态学：大小不一大小不一 逐渐一致逐渐一致增殖力更强：增殖力更强：DNA

2、DNA合成期、分裂期达合成期、分裂期达50%突变性：突变性：不同于正常细胞，失去稳定的控制高分化不同于正常细胞，失去稳定的控制高分化 变低分化变低分化表面性状：表面性状：负电荷数量负电荷数量正常，贴壁性正常，贴壁性 ，抗原性可，抗原性可 变异变异接触抑制减弱或消失：接触抑制减弱或消失：悬浮生长特征：悬浮生长特征：成瘤性：成瘤性：移植到动物体内可成瘤移植到动物体内可成瘤第三页，共49页幻灯片肿瘤细胞肿瘤细胞in vitro in vitro 培基培基RPMI1640：最常用，最常用，+10+1020%FCS20%FCS，上皮性，上皮性 或悬浮性（或悬浮性（+0.03%+0.03%谷氨酰胺）谷氨酰

3、胺）DMEM：常用常用F12： 适用于上皮性癌，如肝癌，适用于上皮性癌，如肝癌，L-15： 注意：注意：+2g/L NaHco3 或或 +20mmol/L HEPESpH7.2RPMI1640+F12或或L-15（1:1）：）：适用肉瘤适用肉瘤第四页，共49页幻灯片培养液特殊添加剂培养液特殊添加剂 常用的促常用的促细胞生长因子及使用的终浓度细胞生长因子及使用的终浓度 添加剂添加剂 终浓度终浓度 添加剂添加剂 终浓度终浓度 BSA 10-5mol/ml EGF 5ng/ml transferrin 5-10 g/ml FGF 5ng/ml insulin 5 pg/ml NGF 5ng/ml 氢

4、化可的松氢化可的松 10-5mol/ml 第五页，共49页幻灯片肿瘤细胞的培养肿瘤细胞的培养与常规细胞培养技术相同与常规细胞培养技术相同 一个细胞群体，存在多种亚群，复杂性一个细胞群体，存在多种亚群，复杂性建株细胞较正常细胞易于培养建株细胞较正常细胞易于培养第六页，共49页幻灯片细胞分裂增殖的调控细胞分裂增殖的调控（细胞周期）（细胞周期）多种基因的协同作用多种基因的协同作用调控因子：调控因子： 基因：基因：Cdc2、 cyclin 蛋白磷酸化蛋白磷酸化 蛋白激酶的调控蛋白激酶的调控 胸苷激酶的调控胸苷激酶的调控 负调：负调：DNA损伤与损伤与DNA修复：抑制抗性修复：抑制抗性 肿瘤细胞肿瘤细胞

5、 第七页，共49页幻灯片细胞间的相互影响细胞间的相互影响不同亚群代表不同分化程度的细胞群不同亚群代表不同分化程度的细胞群 表型、形态、受体、对因子的反应等表型、形态、受体、对因子的反应等 均不同均不同不同亚群释放不同的正负调节因子不同亚群释放不同的正负调节因子 (阴阳调控阴阳调控)第八页，共49页幻灯片细胞因子与激素对肿瘤细胞的调控细胞因子与激素对肿瘤细胞的调控一个重要而复杂的因素一个重要而复杂的因素 因素因素 高分化高分化 低分化低分化胰岛素胰岛素 生长生长 -凝血孝素凝血孝素 生长生长 -前列腺素前列腺素 促进（促进（400) 抑制抑制激情素激情素 - 助黏附助黏附维生素维生素A 抑制生长

6、及分化抑制生长及分化_调整培基中的成分可调控细胞的生长与分化调整培基中的成分可调控细胞的生长与分化第九页，共49页幻灯片影响培养肿瘤细胞生长的因素影响培养肿瘤细胞生长的因素PH营养：如血清效价低营养：如血清效价低细胞生长因子的自分泌及旁分泌细胞生长因子的自分泌及旁分泌癌基因抑癌基因的变化癌基因抑癌基因的变化排泄废物的影响排泄废物的影响细胞外基质的作用细胞外基质的作用细胞相互间的作用细胞相互间的作用污染污染第十页，共49页幻灯片培养技术培养技术 - - 取材取材手术标本手术标本活检标本活检标本胸腹水穿刺胸腹水穿刺细针头穿刺细针头穿刺内窥镜活检内窥镜活检 关键：新鲜、无菌、及时、准确关键：新鲜、无

7、菌、及时、准确第十一页，共49页幻灯片技术技术- - 分离纯化分离纯化分离：分离：剪碎、酶消化、剪碎、酶消化、Ficoll、Percoll等等 密度沉降分离密度沉降分离纯化：纯化：反复贴壁去除成纤维细胞反复贴壁去除成纤维细胞 自然淘汰去除正常细胞自然淘汰去除正常细胞 利用特异抗原标志筛选法利用特异抗原标志筛选法( panning) 分亚型分亚型 流式细胞仪分选流式细胞仪分选 克隆建株克隆建株 高转移株的建立：反复接种高转移株的建立：反复接种第十二页，共49页幻灯片技术技术- -培养培养原代培养：原代培养：去除纤维细胞及淋巴细胞，去除纤维细胞及淋巴细胞， 防止细菌、真菌污染。防止细菌、真菌污染。

8、传代培养：传代培养：增殖力低的细胞需要饲养增殖力低的细胞需要饲养 细胞适当密度细胞适当密度, 基本长满后基本长满后 传代传代, 前前10代不稳定，注意代不稳定，注意 培养条件，适当调整培基。培养条件，适当调整培基。第十三页，共49页幻灯片技术技术- - 鉴定与建株鉴定与建株鉴定：鉴定：组织来源组织来源 、形态特征、核型染色体分析、形态特征、核型染色体分析、生长特性、对细胞因子的反应（生长特性、对细胞因子的反应（TNF)、集落形、集落形成、致瘤实验（裸小鼠）成、致瘤实验（裸小鼠）建株：建株：生长半年以上，病理诊断、光镜及电镜观生长半年以上，病理诊断、光镜及电镜观察、生长特征、染色体分析、肿瘤标志

9、、致瘤及察、生长特征、染色体分析、肿瘤标志、致瘤及转移情况转移情况注意：注意：不是每一肿瘤组织都能建株不是每一肿瘤组织都能建株第十四页，共49页幻灯片应用应用- - 肿瘤治疗的研究肿瘤治疗的研究治疗药物敏感性的鉴定与筛选治疗药物敏感性的鉴定与筛选肿瘤的多药耐药性的鉴定肿瘤的多药耐药性的鉴定各种新药治疗的实验研究各种新药治疗的实验研究 体外：体外：肿瘤的生长（肿瘤的生长（3HTdr掺入）掺入） 肿瘤的杀伤率（肿瘤的杀伤率（MTT、51Cr释放）释放） 体内：体内：裸鼠或免疫功能抑制鼠，成瘤率、抑瘤裸鼠或免疫功能抑制鼠，成瘤率、抑瘤 生长率、转移率、生存时间及死亡率生长率、转移率、生存时间及死亡率

10、 作用机理的研究：作用机理的研究：基因、蛋白、酶、标志、受体基因、蛋白、酶、标志、受体第十五页，共49页幻灯片肿瘤细胞培养的应用肿瘤细胞培养的应用肿瘤细胞的遗传特性：肿瘤细胞的遗传特性：各种癌基因及抑各种癌基因及抑癌基因的分析、染色体定位（癌基因的分析、染色体定位（FISH法）法）肿瘤细胞的生物学行为：肿瘤细胞的生物学行为：细胞周期细胞周期（FACS)、信号传递、信号传递肿瘤细胞的标志与激素、受体变化肿瘤细胞的标志与激素、受体变化（免（免疫细胞化学、放射自显影、酶免疫、荧疫细胞化学、放射自显影、酶免疫、荧光免疫、放射免疫、免疫印迹）光免疫、放射免疫、免疫印迹）第十六页，共49页幻灯片第十七页，

11、共49页幻灯片单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备第十八页，共49页幻灯片单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 基本原理：基本原理：Bunet抗体选择学说，每个抗体选择学说，每个B细胞只细胞只能够产生一种针对它的特异性抗原决定簇的能够产生一种针对它的特异性抗原决定簇的抗体。从一个祖先抗体。从一个祖先B细胞分裂繁殖形成的纯细胞分裂繁殖形成的纯细胞系，称为克隆。细胞系，称为克隆。第十九页，共49页幻灯片单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 单克隆抗体定义：来自克隆系的细胞基因完全相单克隆抗体定义：来自克隆系的细胞基因完全相同，产生的抗体完全相同。这种从一株克隆系产同，产生的抗体完全相同。这种从一株克隆系产生的

12、抗体生的抗体 单克隆抗体（单克隆抗体（McAb)。 1975年年Kohler 和和 Milstein 首先利用细胞融合首先利用细胞融合技术制备了永久分泌单克隆抗体的杂交瘤细技术制备了永久分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。胞株。第二十页，共49页幻灯片单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备特点：特点：肿瘤细胞易体外培养和长期生长；肿瘤细胞易体外培养和长期生长； B淋巴细胞淋巴细胞 分泌特异性抗体；分泌特异性抗体； 二者杂交融合杂交瘤，继承二者性质。二者杂交融合杂交瘤，继承二者性质。 HAT培基：培基：H次黄嘌呤、次黄嘌呤、 A氨基蝶呤氨基蝶呤 T胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷 第二十一页，共49页幻灯片单克隆抗

13、体的制备单克隆抗体的制备肿瘤细胞肿瘤细胞DNA合成途径：合成途径： 叶酸衍生物叶酸衍生物 氨基酸、小分子化合物合成氨基酸、小分子化合物合成DNA HGPRT -TK 次黄鸟嘌呤磷酸核糖转移酶次黄鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶 核苷酸前体核苷酸前体第二十二页，共49页幻灯片单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备HAT特点：特点：“A” 叶酸拮抗物叶酸拮抗物骨髓瘤骨髓瘤-骨髓瘤：骨髓瘤：DNA合成途径阻断；缺合成途径阻断；缺HGPRT， 不能利用不能利用“H”死亡。死亡。脾细胞脾细胞-脾细胞：脾细胞：有有HGPRT，缺增殖能力，缺增殖能力死亡。死亡。骨髓瘤骨髓瘤-脾细胞：脾细胞：

14、HGPRT+无限增殖能力无限增殖能力 存活。存活。第二十三页，共49页幻灯片单克隆抗体的制备方法单克隆抗体的制备方法抗原：抗原：纯度、分子量。纯度、分子量。1. 细胞细胞12 1072. 可溶性蛋白质抗原可溶性蛋白质抗原10 100 g动物：动物：BALB/C鼠，周龄：鼠，周龄：68周，雌性周，雌性佐剂：佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、脂质体福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、脂质体第二十四页，共49页幻灯片免免 疫疫 方方 法法1.常规免疫：常规免疫：腹腔或颈部多点皮下腹腔或颈部多点皮下 0 天：天：基础免疫基础免疫抗原抗原+完全佐剂完全佐剂 15天：天：基础免疫基础免疫抗原抗原+不完全佐剂不

15、完全佐剂 30天：天：基础免疫基础免疫抗原抗原+不完全佐剂不完全佐剂 45天：天：追加免疫追加免疫同量抗原同量抗原 48天：天：进行细胞融合进行细胞融合 第二十五页，共49页幻灯片免免 疫疫 方方 法法备注：备注：1. 细胞、细菌、病毒等颗粒性抗原有较细胞、细菌、病毒等颗粒性抗原有较强抗原性，可不加佐剂，直接腹腔注射。强抗原性，可不加佐剂，直接腹腔注射。2. 可溶性蛋白质抗原需加佐剂。可溶性蛋白质抗原需加佐剂。本研究室经验：本研究室经验：第二十六页，共49页幻灯片免免 疫疫 方方 法法2. 脾内免疫：脾内免疫：2.1 0 天：基础免疫天：基础免疫 15 天：脾内免疫天：脾内免疫 18 天：细胞

16、融合天：细胞融合2.2 0 天：脾内免疫天：脾内免疫 4 天：细胞融合天：细胞融合第二十七页，共49页幻灯片免免 疫疫 方方 法法脾内免疫脾内免疫优点：优点：时间短，使用抗原量少。时间短，使用抗原量少。 可溶性抗原：可溶性抗原：210 g 细胞抗原：细胞抗原：1 105缺点：缺点：效果差于常规免疫，尤其无基础免效果差于常规免疫，尤其无基础免 疫的脾内免疫。疫的脾内免疫。第二十八页，共49页幻灯片免免 疫疫 方方 法法脾内免疫方法：脾内免疫方法： BALB/C小鼠乙醚麻醉，右卧位，消小鼠乙醚麻醉，右卧位，消毒，无菌操作剪开皮肤，透过腹膜，用毒，无菌操作剪开皮肤，透过腹膜，用 4号针头注射器注入脾

17、脏，尽量刺深，勿刺号针头注射器注入脾脏，尽量刺深，勿刺透，纵轴方向，边退边注射或多点注射。透，纵轴方向，边退边注射或多点注射。注意事项：注意事项： 抗原体积抗原体积 0.2 ml，脾内逐步注射后，脾内逐步注射后，针头拔出口时要停留片刻，针头拔出口时要停留片刻， 缝合切口或用缝合切口或用医用黏合剂涂抹切口。医用黏合剂涂抹切口。第二十九页，共49页幻灯片免免 疫疫 方方 法法3 . 弱免疫原免疫方案；弱免疫原免疫方案； 0 天：基础免疫天：基础免疫 30 天：基础免疫天：基础免疫 45 天：基础免疫天：基础免疫 60 天：基础免疫天：基础免疫 75 天：基础免疫天：基础免疫 6个月内，至鼠血清测出

18、抗体产生。静脉个月内，至鼠血清测出抗体产生。静脉 或脾内追加免疫后或脾内追加免疫后7296h细胞融合。细胞融合。第三十页，共49页幻灯片免免 疫疫 方方 法法4. 体外免疫：体外免疫： 分离小鼠脾细胞，置分离小鼠脾细胞，置 10% 20% FCS RPMI1640培基，加适量滋养细胞与抗原培基，加适量滋养细胞与抗原（可溶性抗原（可溶性抗原 0.5 5 g/ ml；细胞性抗原；细胞性抗原10 5106/ ml），），37，5%CO2 培养培养 3 天，天，再分离淋巴细胞与骨髓瘤细胞，融合。再分离淋巴细胞与骨髓瘤细胞，融合。第三十一页，共49页幻灯片单单 克克 隆隆 抗抗 体体 制制 备备一一.滋

19、养细胞制备：滋养细胞制备：1. 机制：机制：不明，通常认为这类细胞释放不明，通常认为这类细胞释放 一种或几种生长因子，提供必要生长一种或几种生长因子，提供必要生长 条件。条件。2. 小鼠腹腔巨噬细胞制备滋养细胞小鼠腹腔巨噬细胞制备滋养细胞 正常无感染正常无感染BALB/C小鼠，处死。小鼠，处死。 75%乙醇浸泡乙醇浸泡 510min，第三十二页，共49页幻灯片单单 克克 隆隆 抗抗 体体 制制 备备 撕开腹部皮肤，撕开腹部皮肤， 充分暴露腹腔，充分暴露腹腔， 提起提起 腹膜，剪开，吸管注入腹膜，剪开，吸管注入5 ml无血清培基，无血清培基， 小心提动或轻揉腹膜，小心提动或轻揉腹膜， 吸出培基。

20、吸出培基。 无血清培基洗无血清培基洗2次，细胞浓度次，细胞浓度2105/ml, 0.1 ml / 孔孔/ 96孔，相当于孔，相当于 2104。通。通 常获常获2106 5106 只。只。第三十三页，共49页幻灯片单单 克克 隆隆 抗抗 体体 制制 备备二二. 骨髓瘤细胞准备：骨髓瘤细胞准备：Sp2/0, NS-1等等1. 复苏，复苏，20%FCSRPMI-1640培基为好。培基为好。2. 培养、传代，取对数生长期细胞（培养、传代，取对数生长期细胞（1105 5 105/ml），按），按1：5 1：10 稀释传代，稀释传代，2、3天扩大培养，选生长状态、形天扩大培养，选生长状态、形态好对数生长期

21、细胞融合用。态好对数生长期细胞融合用。3. RPMI-1640培基洗培基洗3次（次（1000r/min 5min )第三十四页，共49页幻灯片单单 克克 隆隆 抗抗 体体 制制 备备注意事项：注意事项：1. 骨髓瘤细胞的细胞活数应在骨髓瘤细胞的细胞活数应在95%，2. 无各种污染，无各种污染，3.骨髓瘤细胞质量保证、生长密度合适。骨髓瘤细胞质量保证、生长密度合适。第三十五页，共49页幻灯片单单 克克 隆隆 抗抗 体体 制制 备备三三. 免疫脾细胞悬液制备：免疫脾细胞悬液制备：1. 免疫免疫BALB/C鼠，放眼血致死（收集眼血制成血鼠，放眼血致死（收集眼血制成血清）。清）。2. 浸泡于浸泡于75

22、%乙醇乙醇515分，入超净台，打开腹分，入超净台，打开腹腔（逐次换器械），取脾。腔（逐次换器械），取脾。3. 剪碎脾脏，注射器内芯研磨过剪碎脾脏，注射器内芯研磨过100目钢筛，目钢筛， 平皿预先平皿预先23ml RPMI-1640，移入圆底试管，移入圆底试管，补加适量培基，静置补加适量培基，静置35分，取上分，取上2/3悬液移入悬液移入50ml离心管，上述反复离心管，上述反复23次。次。第三十六页，共49页幻灯片单单 克克 隆隆 抗抗 体体 制制 备备三三. 免疫脾细胞悬液制备：免疫脾细胞悬液制备：5. 上述培基洗细胞上述培基洗细胞2次（次（ 1000r/min 10 min ），），6. 不

23、完全培基不完全培基10ml重悬液，台盼蓝计数活重悬液，台盼蓝计数活 脾细胞数，脾细胞数，1 10 8 2.5 10 8 /只。只。第三十七页，共49页幻灯片单单 克克 隆隆 抗抗 体体 制制 备备四四. 50%PEG的准备：的准备： 融合前，称融合前，称PEG（mw = 4000) 2g，置小，置小瓶内，低压消毒（瓶内，低压消毒（8磅），磅），15min,取出立即取出立即边加边摇加入边加边摇加入2ml完全培基，（内含完全培基，（内含0.3%ml二二甲基亚枫，以提高融合率），至完全混合，甲基亚枫，以提高融合率），至完全混合，4 保存。用前保存。用前37 预热。要求预热。要求PEG现配，防止现配，

24、防止PH变碱。变碱。第三十八页，共49页幻灯片单单 克克 隆隆 抗抗 体体 制制 备备五五. 细胞融合：细胞融合：1. 将准备好的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于将准备好的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于 50ml离心管内（脾细胞离心管内（脾细胞1 10 8，骨髓瘤细胞，骨髓瘤细胞1 10 7）。用）。用SP2/0时，脾细胞：骨髓瘤细胞以时，脾细胞：骨髓瘤细胞以10：1为好；用为好；用NS-1，脾细胞：骨髓瘤细胞以，脾细胞：骨髓瘤细胞以5：1为好。为好。第三十九页，共49页幻灯片单单 克克 隆隆 抗抗 体体 制制 备备2. RPMI-1640培基洗培基洗2次（次（1500r /min/8min）；）；3. 倾

25、倒上清，吸尽残留液，轻弹管底，倾倒上清，吸尽残留液，轻弹管底， 使细胞使细胞疏松，离心管移至超净台预先放置的疏松，离心管移至超净台预先放置的37 水浴。水浴。4. 1 ml 吸管吸取吸管吸取 0.8 ml 37 PEG，110 8 脾细胞脾细胞+ 0.8 ml PEG，边加边摇，边加边摇，60s内加完，内加完，轻摇轻摇1.5 min。5 min内内摇动缓和摇动缓和加入加入10 ml 预预 温温37 的的RPMI-1640。第四十页，共49页幻灯片单单 克克 隆隆 抗抗 体体 制制 备备注意：注意： 第第1 min 加加 1 ml; 第第2 min 加加 1 ml; 第第3 min 加加 1.5

26、 ml; 第第4 min 加加 1.5 ml; 第第5 min 加加 5 ml; 再补加再补加40 ml。 离心：离心：1000r / min / 5min.第四十一页，共49页幻灯片单单 克克 隆隆 抗抗 体体 制制 备备5. 移出上清，取少量移出上清，取少量HAT小心吹散细胞，细小心吹散细胞，细 胞移入胞移入HAT培基中，按免疫脾细胞培基中，按免疫脾细胞210 5 / 孔孔/96孔，孔， 加入加入 0.1 ml 0.2 ml/孔（已加入融合当天孔（已加入融合当天制备的滋养细胞），制备的滋养细胞）， CO2 孵箱孵箱 37 。提示：提示：接种接种1012块块96孔板，使孔板，使80%杂交瘤生

27、长为杂交瘤生长为单克隆，减少克隆化次数，阳性孔不易丢失。单克隆，减少克隆化次数，阳性孔不易丢失。第四十二页，共49页幻灯片单单 克克 隆隆 抗抗 体体 制制 备备六六. 融合细胞观察与换液：融合细胞观察与换液：1. 第第23天骨髓瘤细胞退化、核缩、碎裂，天骨髓瘤细胞退化、核缩、碎裂， 增生、吞噬碎片；增生、吞噬碎片；第第45天可见小堆天可见小堆杂交瘤细胞生长。记录。杂交瘤细胞生长。记录。2. 融合后融合后57天确认骨髓瘤细胞全部死亡，天确认骨髓瘤细胞全部死亡， 毛细吸管吸出毛细吸管吸出0.1ml 0.15ml HAT，换成同量换成同量HT培基。培基。第四十三页，共49页幻灯片单单 克克 隆隆

28、抗抗 体体 制制 备备七七. 杂交瘤抗体检测：杂交瘤抗体检测： 培基变黄，杂交瘤细胞占孔底面积培基变黄，杂交瘤细胞占孔底面积1/4、状、状态好，可测上清液抗体（非分泌性比分泌性杂态好，可测上清液抗体（非分泌性比分泌性杂交瘤长速快），及时测抗体及时克隆化，以免交瘤长速快），及时测抗体及时克隆化，以免目的杂交瘤丢失。目的杂交瘤丢失。 测定时间：融合后测定时间：融合后1015天，第次换液天，第次换液3天后，天后，ELISA、冰冻切片荧光技术等。、冰冻切片荧光技术等。 阳性孔杂交瘤转入阳性孔杂交瘤转入24孔板，孔板，1天后细胞状态天后细胞状态 好即可克隆化。好即可克隆化。第四十四页，共49页幻灯片单单 克克 隆隆 抗抗 体体 制制 备备八八. 克隆化：有限稀释法。克隆化：有限稀释法。1. 按前述准备新鲜滋养细胞用按前述准备新鲜滋养细胞用HTHT培基接种培基接种 9696孔孔板，板，0.1ml/0.1ml/孔。孔。2. 向向2424孔板加孔板加0.9 ml/0.9 ml/孔孔HTHT，通常每