第8章蛋白质分析和膜泡转运

1、第8章 蛋白质分选与膜泡运输主讲：张东旭 副教授电话mail:第一节 细胞内蛋白质的分选 细胞内合成的蛋白质之所以能够定向的转运到特定的细胞器取决于蛋白质中包含的特殊信号序列和细胞器上特定的信号识别装置。一、信号假说与蛋白质分选信号 蛋白质的分选（protein sorting） 信号序列的发现和证实1972年Milstein等发现骨髓瘤细胞中提取的免疫球蛋白分子的N端要比分泌到细胞外的免疫球蛋白分子N端的氨基酸序列多出一截。1975年Blobel和Sabatini等提出了”信号假说信号假说“布洛贝尔因为发现“蛋白质具有控制其在细胞内转移和定位的信号”而获得1999年

2、度诺贝尔生理学/医学奖。 G. Blobel1. 信号假说信号肽（signal peptide）信号识别颗粒（signal recognition particle，SRP）信号识别颗粒的受体（又称停泊蛋白，docking protein，DP）（1）信号肽（signal peptide） 位于蛋白质的N 端，一般由1626 个残基组成 包括疏水核心区疏水核心区、信号肽的信号肽的C 端端和N 端端等3 部分 原核细胞某些分泌性蛋白的N 端也具有信号序列信号肽的一级结构序列信号肽的一级结构序列信号肽似乎没有严格的专一性（2）信号识别颗粒（SRP） 由6 种不同的蛋白质和一个由300 个核苷酸组成

3、的 7S RNA 结合组成的一种核糖核蛋白复合体蛋白质翻译过程与SRP、DP和微粒体的关系 体外非细胞系统（cell free system）进行蛋白质合成实验，证实分泌性蛋白向rER（微粒体）腔内的转运是同蛋白质翻译过程偶联进行的，这种分泌蛋白在信号肽引导下边翻译边跨膜转运的过程称为共翻译转运 （cotranslational translocation）（3）分泌性蛋白的合成与其共翻译转运分泌性蛋白的合成与其跨越内质网膜的共翻译转运图解 图示信号肽、SRP、DP 及移位子之间的相互作用（3）分泌性蛋白的合成与其共翻译转运（3）分泌性蛋白的合成与其共翻译转运（4）膜整合蛋白的信号序列 开始转

4、移序列（start transfer sequence） 内在停止转移锚定序列（internal stop-transfer anchor sequence, STA） 内在信号锚定序列（internal signal anchor sequence, SA）内质网膜整合蛋白的拓扑学类型 2. 蛋白质分选信号序列信号肽与信号斑二、蛋白质分选转运的基本途径与二、蛋白质分选转运的基本途径与类型类型 途径途径（1）后翻译转运途径（2）共翻译转运途径 类型类型（1）蛋白质的跨膜转运（2）膜泡运输（3）选择性的门控转运（4）细胞质基质中蛋白质的转运 1. 翻译后转运途径：在细胞质基质游离核糖体上完成多肽

5、链合成，然后转运至膜围绕的细胞器，如线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、细胞核及细胞质基质的特定部位。 2. 共翻译转运途径：蛋白质合成起始后转移至粗面内质网，新生肽边合成边转入粗面内质网腔中，随后经高尔基体转运至溶酶体、细胞膜或分泌到细胞外，内质网与高尔基体本身的蛋白也是通过这条途径分选的。蛋白质分选的基本途径 跨膜转运：主要指再细胞质基质中合成的蛋白质转运到内质网、线粒体、质体（包括叶绿体）和过氧化物酶体等细胞器。 膜泡运输：蛋白质通过不同类型的转运小泡从糙面内质网合成部位转运至高尔基体，进而分选转运至细胞的不同部位，其中涉及各种不同的运输小泡的定向转运，以及膜泡出芽与融合的过程。 选择性的门控

6、转运：在细胞质基质中合成的蛋白质通过核孔复合体选择性地完成核输入或从细胞核返回细胞质（核输出）。 细胞质基质中蛋白质的转运：可能与细胞骨架系统相关。蛋白质分选转运的4种基本类型真核细胞蛋白质分选的主要途径与类型三、蛋白质向线粒体、叶绿体和过氧化物酶体的分选信号肽导肽转运肽PTS1/PTS2核定位信号NLS（一）蛋白质从细胞质基质输入到线粒体 蛋白质从细胞质基质输入到线粒体基质 蛋白质从细胞质基质输入到线粒体内膜 蛋白质从细胞质基质输入到 线粒体膜间隙蛋白质从细胞质基质输入到线粒体基质线粒体蛋白通过3 种途径从细胞质基质输入到线粒体内膜线粒体蛋白通过两种途径从细 胞质基质输入到线粒体膜间隙核基因

7、编码的线粒体蛋白的转运（二）叶绿体基质蛋白与类囊体蛋白的靶向输入 外膜蛋白 内膜蛋白 叶绿体基质蛋白 类囊体膜蛋白 类囊体腔蛋白叶绿体蛋白从 细胞质基质输入到类囊体腔（三）过氧化物酶体蛋白的分选 C端SKL(Ser-Lys-Leu)靶向序列 可溶性细胞质受体 过氧化物酶体膜受体 信号序列不被切除 ATP水解(?)第二节 膜泡转运细胞犹如繁忙而巨大的港口，将正确的货物在正确的时间运送细胞犹如繁忙而巨大的港口，将正确的货物在正确的时间运送到正确的地点是最为要紧的，囊泡就是港口的到正确的地点是最为要紧的，囊泡就是港口的“穿梭巴士穿梭巴士”。人们早已了解大量分子人们早已了解大量分子(即即“乘客乘客”)

8、是是“搭乘搭乘”囊泡在细胞内囊泡在细胞内外往来，却一直不了解这辆巴士是如何确定自己的启程时间及外往来，却一直不了解这辆巴士是如何确定自己的启程时间及目的地的。目的地的。 兰迪谢克曼 早在上世纪早在上世纪70年代，兰迪年代，兰迪谢克曼便利用酵母作为模谢克曼便利用酵母作为模型，开始研究其遗传学基础。在基因筛选过程中，型，开始研究其遗传学基础。在基因筛选过程中，谢克曼分离出一类异常转运机制的酵母细胞。这株谢克曼分离出一类异常转运机制的酵母细胞。这株酵母的酵母的“运输状况运输状况”与混乱的公共交通系统类似，与混乱的公共交通系统类似，囊泡都堆积在细胞的某一个角落。随后，谢克曼发囊泡都堆积在细胞的某一个角

9、落。随后，谢克曼发现了导致这一拥堵状况的罪魁祸首现了导致这一拥堵状况的罪魁祸首3类编码调节类编码调节囊泡运输关键蛋白的基因。囊泡运输关键蛋白的基因。 上世纪80年代90年代，詹姆斯罗斯曼在哺乳动物细胞研究中发现了囊泡与“乘客”精确对接的奥秘囊泡的膜及目的细胞器的膜上均有高度特异性的蛋白复合物，两者能够像拉链一样紧密嵌合，从而使囊泡融合到细胞膜之中，由此解决了囊泡“释放”问题，确保了“乘客”准确、及时到达。更为重要的是，回顾兰迪谢克曼发现的控制囊泡运输的关键基因中，含有编码詹姆斯罗斯曼教授所发现的蛋白质复合物的基因，说明囊泡运输在进化上的保守性。从低等生物(酵母)到高等生物(哺乳动物)均存在囊泡

10、运输，说明它是生命活动的基本途径。 如果说罗斯曼与谢克曼的发现可以解释囊泡作为一辆“穿梭巴士”是如何准确接送“乘客”的，那么祖德霍夫的研究成果则阐明细胞运输系统在时间上的精确性，并指出“乘客”须有指令方能下车的信号问题。上世纪90年代，祖德霍夫聚焦于神经细胞中的钙离子敏感蛋白，描摹出钙离子流动的分子机制，并发现了突触囊泡感受外界信号的关键因子和关键蛋白钙离子和钙结合蛋白，通过它们，突触小泡接受信号，快速准确地释放，完成神经信号的传递。 一、膜泡运输概观一、膜泡运输概观1. 蛋白质在rER 合成，通过共翻译转运途径跨膜运输2. 内质网出芽，形成转运膜泡并与高尔基体融合3. 从高尔基体顺面膜囊和高

11、尔基体顺面网状结构到rER的逆向运输4. 高尔基体膜囊从顺面反面成熟递进（非膜泡过程）5. 从高尔基体后期膜囊早期膜囊的逆向运输6. 组成型分泌7. 调节型分泌8. 分选到溶酶体9. 胞吞途径蛋白质的分泌与胞吞途径概观蛋白质的分泌与胞吞途径概观三种包被的膜泡 COP（coat protein ） 包被膜泡 COP（coat protein）包被膜泡 网格蛋白/ 接头蛋白（clathrin/ adaptor protein）包被膜泡三种包被膜泡特征比较二、二、COP 包被膜泡的装配与运输包被膜泡的装配与运输 COP包被蛋白组分 小分子GTP 结合蛋白Sar1 Sec23/Sec24 复合物 Se

12、c13/Sec31 复合物 大的纤维蛋白Sec16细胞质中可溶性 Sar1- GDP 与ER 膜蛋白Sec12（鸟苷酸交换因子）相互作用， 催化GTP 置换GDP 形成Sar1-GTP，GTP 的结合引发 Sar1 构象改变暴露出疏水N 端并插入ER 膜，膜结合Sar1 对包被蛋白进一步装配起募集者作用小分子GTP 结合蛋白Sar11. Sar1与膜结合与膜结合GTP交换交换 2. COP包被装配包被装配 3. GTP水解水解 4. COP包被去装配包被去装配Sar1 蛋白在Cop包被膜泡装配与去装配中作用在内质网与高尔基体之间，分别由COP和COP膜泡介导蛋白质顺向和逆向转运不同类型的膜泡运

13、输 KDEL 受体在从高尔基体回收内质网腔驻留蛋白中的作用不同类型的膜泡运输 在供体膜内质网出芽及其转运蛋白的包装示意图不同类型的膜泡运输 三、三、COP 包被膜泡的装配与运输包被膜泡的装配与运输COP包被含有7 种不同的蛋白质亚基和一种调节膜泡转运的 GTP 结合蛋白ARF。ARF 也是一种结合 GDP/GTP 转换的分子开关调控蛋白。包被蛋白复合物 的装配与去装配依赖于ARF 所结合的核苷酸交换与水解过程KDEL 的受体主要定位在高 尔 基 体 T G N 区 、COP和COP包被膜泡的膜上，它们能识别并 结合KDEL 分选信号。如果在内质网发 生错误包装和转运，由于COP膜泡上也有KDE

14、L 受体，所以也能保证逃逸蛋白被内质网回收KDEL 的受体四、网格蛋白四、网格蛋白/接头蛋白包被膜泡的接头蛋白包被膜泡的装配与运输装配与运输 网格蛋白/ 接头蛋白包被膜泡介导的蛋白质分选途径 从高尔基体TGN向胞内体或向溶酶体、 黑（色）素体、血小板囊泡和液泡的运输 受体介导的胞吞途径中负责将物质从细胞表面运往胞内体转而到溶酶体的运输网格蛋白及其包被膜泡的形成五、转运膜泡与靶膜的锚定与融合五、转运膜泡与靶膜的锚定与融合 供体膜的出芽、装配和断裂，形成不同的包被转运膜泡 在细胞内由马达蛋白驱动、以微管为轨道的膜泡运输 转运膜泡与特定靶膜的锚定和融合过过 程程胞质中Rab 蛋白在特异性鸟苷酸交换因子（GEF）催化下，Rab-GDP 转换为Rab-GTP，构象改变致使其通过类异戊二烯基团插入转运膜泡表面，与靶膜上Rab 效应器结合蛋白相互作用，从而使转运膜泡被锚定在靶膜上Rab 蛋白参与膜泡的锚定供体膜和靶膜之间膜泡的锚定与融合模式六、细胞结构体系的组装六、细胞结构体