尿路致病性大肠埃希菌疫苗的研究进展.docx

1、综述尿路致病性大肠埃希菌疫苗的研究进展曹阳，建殿军关键词：尿路致病性大肠埃希菌；疫苗；进展中图分类号:R378.21文献标志码：A文章编号：1009-7708(2014)06-0545-05UpdateonthedevelopmentofuropathogenicEscherichiacolivaccineCAOYang,WEIDianjun.(DepartmentofLaboratoryMedicine,SecondHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300211China)尽管有正常的尿液流动、强大的生理屏障以及一系列的宿主防御系统，但是人类

2、的泌尿道仍然是最常见的细菌感染部位。大多数尿路感染最初的表现是膀胱炎,进而引起急性肾盂肾炎.在某些严重的情况下.细菌可以突破肾脏的E皮和内皮屏障进人血流，导致全身性感染和脓毒症虽然有多种细慎可以感染人类泌尿道，但超过80%尿路感染是由尿路致病性大肠埃希菌（uropathogenicEscherichiacoliUPEC）引起的。UPEC不同于肠道正常菌群中的大肠埃希菌.它编码一些额外的基因和毒力因子，包括毒素、黏附素、铁摄取系统、代谢酶和结构成分，便于感染宿主的泌尿道。抗生素是目前治疗尿路感染的最常见手段，但反复抗生素治疗可以引起细菌耐药率的大幅度提升，同时破坏患者体内的正常菌群，导致继发感染

3、。2000年后与2（）世纪90年代相比,UPEC对某些哇诺胴类药物的耐药率上升超过50%,对阿米卡星的敏感率下降超过了20%,而且多重耐药菌株比例明显增多。国际膀胱炎相关的抗生素耐药性流行病学调查（ARESC）显示，超过10%引起膀胱炎的大肠埃希菌为多重耐药菌。因此，采用-种更廉价、更有效的手段势在必行，而以尿路感染中最常见的UPEC为靶位进行疫苗开发的研究在国内外正处于热点之中。作者单位：天津医科大学第二医院检验科，天津300211.作者简介：普阳（1979），男.硕士，主管技师.主要从事医院感染及分子流行病学研究.通信作者：魏殿军，E-mail；weidianjun.一、UPEC疫苗概况成

4、功的UPEC疫苗需要有以下的特点：应有高度的免疫原性，感染时在宿主体内能被细菌所表达，同时能暴露在细菌的表面便于宿主免疫系统接近并识别，而且它应该是病原体特异性的，避免宿主免疫系统攻击自身胃肠道中的正常共生的大肠埃希菌。在设计疫苗时，还要考虑到UPEC种群的异质性，因为普遍存在于UPEC菌株的核心毒力因子尚有待确认。此外，它还能诱导宿主在泌尿道产生强大的黏膜免疫应答。为了更好地建立这种免疫应答，新型的抗原呈递系统和免疫佐剂也正处于研究之中孔二、表面多糖疫苗和其他革兰阴性杆菌一样，UPEC的细胞表面富含多糖其中包括有保护作用的脂多糖（O抗原）和荚膜多糖（K抗原）。脂多糖与荚膜多糖作为UPEC的毒

5、力因子可以使其逃避宿主的免疫攻击，如调理吞噬和补体介导的细胞毒作用。近期研究显示，UPEC的英膜多舫与脂多糖可以遮蔽细菌表面荚膜下的表位，阻止宿主抗体的识别，意味着表而多糖还可以通过其他的机制影响宿主的免疫应答。早期尿路感染疫苗的研究主要集中在这些表面多糖上，而且在上行尿路感染的动物模型中确实激发了宿主的保护性免疫应答然而大肠埃希菌的表面多糖存在大量的抗原异质性，包括167种O血清型和80多种K血清型明。尽管某些（）抗原和K抗原在UPEC中较为普遍，但仅依靠这些表面多糖抗原研制针对所有UPEC都有效果的疫苗还是有巨大困难口门。此外，许多UPEC的荚膜多糖免疫原性较差，它们可以通过与宿主交叉共有

6、结构组分逃避免疫攻击。例如，英膜抗原KI存在于大约30%肾盂肾炎UPEC菌株中.由多聚2-8连接唾液酸构成U”.在人神经细胞黏附分子的糖类构成中可以找到相同的组分。人类的免疫系统针对白身抗原有保护机制，阻止其多聚a-2-8连接唾液酸特异性抗体的产生，K1阳性的UPEC得以逃避宿主的免疫监视。其他如英膜抗原K5也有类似的机制免疫原性低和高度的异质性是阻碍尿路感染多糖疫苗发展的主要原因。三、多菌株全细胞裂解物疫苗含有灭活病原体裂解物的疫苗可以有效地激活宿主产生保护性免疫.如百日咳、霍乱和伤寒灭活全帽体疫苗。现在已有4种全细胞/细胞裂解物疫苗用于尿路感染，但效果不明显。其中.Urovac疫苗设计的目

7、的是提供广泛的保护，它包括10株灭活的尿路病原体：6株UPEC.奇异变形杆隋、摩根摩根菌、粪肠球菌和肺炎克雷伯菌各1株。Urovac疫苗中的UPEC菌株含有儿种毒力因子，包括溶血素，1、P和S型菌毛.CNF1,几种铁载体以及大肠埃希菌CFT073毒力岛。同时包含的血清型有（）1,4,6,17,75.77；K13,5,13,95和H1,5.7,333】。有反复尿路感染的志愿者在肌内注射1剂Urovac疫苗后的12个月内，感染复发率较未注射疫苗的人群显著下降山】。OM-89/Uro-Vaxorn是另一种类似的疫苗，为1K株UPEC膜蛋白冻干混合物。Uro-Vaxom为胶囊制型，每日口服，已通过几组

8、双盲、安慰剂对照临床试验证明其安全性和有效性一份涉及5项临床研究、总计601例女性患者.90d疗程的荟萃分析结果显示，在预防尿路感染反复发作上Uro-Vaxom比安慰剂明显有效Urvakol和UROstim是第3、4种全细胞疫苗，为口服药片，每H给药，2种疫苗均包含灭活的尿路致病萌混合物.包括大肠埃希菌、奇异变形杆菌和粪肠球菌，两者的区别是Urvakol包含铜绿假单胞菌，而UROstim包含肺炎克雷伯菌。来自于动物和患者的研究结果显示，接种后两者都具有免疫刺激活性，在患者的血清、尿液和唾液中均有疫苗特异性抗体，同时有细胞因子的产生。但两者预防夏发性尿路感染的作用还未被确认，完整的临床试验也还没

9、有完成。四、基因工程疫苗除了全细胞裂解物疫苗正在进行临床试验外.基于UPEC转基因菌株的疫苗也处于研究之中。为了搞清是否UPEC免疫原性较差的表面多糖阻碍了宿主体液免疫应答的产生，Russo等将1株经基因改造的UPECCP923免疫小鼠.该菌株由于转座子的插入不能产生荚膜和脂多糖，将甲醛灭活的CP923鼻内免疫小鼠后，与免疫野生型亲代菌株CP9相比，小鼠的体液免疫应答显著增强，而旦均为直接针对非荚膜、非脂多精的抗体.对于UPEC这种异质性高的菌株，CP923确实为一种令人满意的疫苗购o然而将CP923疫苗鼻内免疫小鼠模型后,与接种PBS缓冲液相比，并不能显著保护小鼠免受C内的人工感染进一步的体

10、外结合与杀菌试验表明.CP923的保护失败主要是由于CP9表而多糖的干扰。UPEC萌株普遍具有荚膜和（）抗原，这些表面多糖的潜在作用就是遮蔽非多糖表位，降低抗体结合的效率。郑玲等将UPECF268P闲毛黏附素Pap（；与谷胱甘肽S转移酶（GST）重组构建融合蛋白GST-PapG皮下注射免疫小鼠，与接种PBS缓冲液相比，小鼠体内相应抗体水平明显升高，肾脏培养菌量明显减少.对小鼠尿道UPECF268上行感染具有一定的免疫保护作用。五、黏附素疫苗UPEC编码大量的黏附素.主要是指那些利于细菌附着或侵入宿主细胞的表面蛋白.例如萌毛。UPEC相比于肠道正常大肠埃希两.其基因组中含有更多的菌毛操纵子理论上

11、如果抗体结合菌毛就能阻止细菌的黏附,预防定植。由于黏附在感染中的关键作用，菌毛自然就成为了UPEC疫苗研究的首要靶位。然而，迄今为止仅有一小部分UPEC菌毛用于尿路感染疫苗的研究.包括P、Dr和1型菌毛。PaPG位于菌毛的顶端可以结合P血型肾上皮细胞表面Gal（a1-4）Gal特异性鞘糖脂，在UPEC定植人肾组织中可能起到关键的作用。在鼠类和灵长类上行尿路感染模型中.利用P菌毛亚基免疫动物发现，其预防肾感染有效】。然而，单-的PaPG在UPEC膀胱定植中作用有限,必须同时有其他组件的疫苗才能提供足够的保护。Dr菌毛结合人类肾小管基底膜和肾小球囊的4型胶原和DAF/CD55。感染Dr萌毛阳性的U

12、PEC小鼠与感染Dr菌毛敲除变异株的小鼠相比，前者肾内细菌载隋更高,持续时间更长,肾小管间质性肾炎更明显口刁。用纯化的Dr菌毛免疫小鼠可产生高效价的抗Dr抗体，并明显降低尿路感染相关的病死率，但不影响膀胱或肾脏的定植率，将Dr阳性UPEC与Dr免疫后的小鼠血清预孵育后再感染小鼠，发现膀胱和肾脏的细菌黏附明显减少，但当Dr阳性UPEC与Dr免疫后的小鼠尿液预孵育后，未发现抗UPEC结合活性.I。改变Dr抗原的接种方式或途径，有可能会提高Dr菌毛疫苗的功效。1型菌毛的FimH通过与膀胱上皮尿溶蛋白的甘露糖残基结合，介导UPEC黏附到膀胱上皮细胞。一种经基因敲除后FimH缺失的变异UPEC萌株不能结

13、合人类和小鼠的膀胱上皮通过药物或宿主自身产生的抗体干扰1型曲毛介导的UPEC与膀胱上皮的黏附，从而预防或治疗膀胱炎，这一发现激励着研究者进一步开发FimH疫苗。以FimHt（FimH截短模式，能与甘露糖结合）或FimCH复合体（伴侣蛋白FimC结合完整的FimH蛋白）免疫小鼠，与仅用佐剂免疫的对照组相比，前者能够明显保护小鼠免受人为膀胱UPEC感染，并降低定植细菌载址为原来的1/100-1/1000C24以FimHt免疫小鼠口j以产生大量并持久的体液免疫应答以及高水平的FimH特异性尿I以FimCH免疫殊猴可以激发强烈的全身体液免疫应答.保护3/4的帝猴免受人为尿路感染，而仅用佐剂免疫的对照组

14、无任何保护作用自从开始FimCH临床试验后的10年间，关于UPEC1型菌毛的进一步研究，使人们对其在人尿路感染中的作用有了更深的理解。对来自活动性尿路感染患者的菌株进行转录分析显示，编码1型菌毛亚基的基因在人尿路UPEC感染时并非高表达。1型菌毛的表达是阶段性改变的，因为它的启动子位于一个可逆的元件上，决定Firn表达的开与关，这种变化可以使入侵的UPEC躲避免疫监视。此外，最近研究发现靶向FimH凝集素结构域的抗体并不阻碍FimH黏附，实际上反而可能增加FimH与甘露糖的亲和力.并且FimH在发生构象改变时抗体还会脱落技。近期有研究显示，UPEC的基因表达在小鼠与人可能不同，虽然上行尿路感染

15、小鼠模型对于设计疫苗和评估有效性很有价值，但是要筛选到更有希望的UPEC疫苗，还需要更完整地掌握人体发生尿路感染时UPEC毒力因子的基因表达情况。六、毒素疫苗灭活的细菌毒素被称作类毒素。目前很多儿童计划免疫的疫苗都是这种类毒素疫苗，例如无细胞百白破疫苗就含有白喉和破伤风类毒素。UPEC基因组含有多种编码毒素的基因，包括a溶血素、细胞密性坏死因子1、细胞致死性肿胀毒素，分泌转运毒素Sai、Pic和Tsh。许多毒素与尿路感染时症状的严重程度有关，如炎性反应增加、膀胱上皮细胞脱落及肾损伤.但是没有一种毒素对于尿路感染必不可少，因此都不适于作为理想的疫苗。将a溶血素肌内注射小鼠,然后人为感染UPEC,

16、发现无明显的保护作用但值得注意的是，与PBS对照组相比，以a溶血素免疫小鼠确实能够明显减少肾损害。虽然类毒素疫苗可能在减少尿路感染发病上作用不明显，但对于降低某些高危人群感染严重程度上可能有一定的效果。七、铁摄取系统疫苗几乎所有的生命形式都需要铁，铁是多种酶的重要辅因子，这些酶在初级、次级细胞代谢以及正常的细胞生理过程中都有十分重要的作用。UPEC能够定植到宿主尿路也要依靠铁摄取系统。虽然人体内含有大量的铁，但大多数都不能被侵入的微生物所摄取.因为它们与血红蛋白的携氧血红素结合，或者以铁蛋白和含铁血黄素的形式储存起来。宿主体内游离铁的缺乏是阻碍微生物生长的主要原因，那些成功的细菌病原体的一大特

17、点就是能够规避这一障碍口9：。UPEC能够在铁缺乏的宿主尿路中生存，主要是通过h.调铁摄取系统的表达，该系统能够合成和分泌铁螯合有机小分子铁载体。铁载体对三价铁有高度的亲和力，能够同宿主蛋白争夺铁。一旦铁被摄取形成复合体，三价铁载体就通过外膜受体被运送到细菌内部，加以利用维持细菌的存活。除了表达自身的特异性外膜铁受体，UPEC还可以表达针对宿主含铁分子（如亚铁血红素）以及其他微生物（如真菌铁载体）的外膜受体。与大部分肠道正常大肠埃希萌仅编码很少的铁摄取系统不同，UPEC表达大量的铁摄取系统如。例如UPEC箫株CFT073的基因组就编码14种外膜铁受体及3种铁载体。许多外膜铁受体都具有成为理想疫

18、苗的特点：它们暴露于细菌表面，感染时表达，并且在UPEC中普遍存在。迄今为止，已有7个UPEC外膜铁受体处于预防尿路感染疫苗的研究之中，包括IroN、IreA、luiA、FyuA、Iha、Hma和ChuA。其中IroN.IreA、lutA、FyuA和Hma对保护小鼠模型免受UPEC感染的效果明显，表明外膜铁受体是很有希望的一类新型UPEC疫苗在人工UPEC感染小鼠模型中，皮下免疫变性的salmochelin铁载体的外膜铁受体Ir。、，对肾脏有明显的保护作用，并且产生强烈的IroN特异性血清IgG应答，但没有诱导产生明显的全身或黏膜IgA反应，对于膀胱的保护也不明显2】，考虑可以通过加入佐剂或改

19、变接种途径来改善。气菌素外膜铁受体lutA以霍乱毒素为佐剂鼻内接种小鼠，发现对膀胱和肾脏都有明显的保护，并且诱导产生的lutA特异性尿路IgA明显增加人但气菌素的产地在UPEC菌株中可能并不充足，因此限制了lutAUPEC疫苗的应用26）。耶尔森杆萌素外膜铁受体FyuA结合弗氏佐剂皮下免疫小鼠，发现能明显保护UPEC感染引起的致命性脓毒症小鼠模型免于死亡叫。研究者不仅关注细萌自身铁载体的外膜受体.而H.将宿主的亚铁血红素细菌外膜受体也作为研制疫苗的目标。亚铁血红素受体Hma以霍乱毒素为佐剂鼻内接种小鼠，发现对人工UPEC感染小鼠的肾脏有明显的保护，但对膀胱的保护不明显出人意料的是，免疫接种另一

20、种亚铁血红素受体ChuA,没有产生明显的保护作用虽然铁摄取系统在UPEC定植上起到关键的作用，但其中必不可少的单-铁摄取系统还没有确定。实际上，许多UPEC铁摄取系统在功能上重登并且表达不均衡，而一个成功的铁载体受体疫苗需要针对不止一种铁摄取系统才能获得更大范围的功效包含许多外膜铁受体决定域的多表位疫苗能够针对数种UPEC铁摄取系统产生保护性免疫。近期，Wieser等M构建了2种多表位亚单位疫苗Voll和Vol2,包含来自大肠埃希菌的6种外膜铁受体FyuA、IroN、ChuA、IreA、lutA和Iha以及尿路致病性特异蛋白（Usp）。Voll或Vol2以霍乱毒素为佐剂鼻内接种小鼠，在人工腹腔

21、UPEC感染后48h,小鼠肝脏内的UPEC载量明显减少。而接种Vol1（含有FyuA、lutA、Iha和Usp决定域）还能够明显减少脾脏中的UPEC细曲载最。多表位疫苗和其他铁受体的研究成果是令人鼓舞的，而UPEC铁摄取系统研究有可能是未来UPEC疫苗设计的方向，甚至也可用于其他依靠铁摄取系统存活的病原体疫苗的研制。八、展望UPEC菌株的特点是异质性强，针对单一毒力因子的疫苗不可能对所有UPEC菌株都有效果，而靶向多重毒力因子，例如多种菌毛黏附素或多种铁受体有可能解决UPEC多样性这一难题。未来为了设计更科学、更有效的尿路感染疫苗，我们还需要进一步了解UPEC的致病机制及宿主针对感染的黏膜免疫

22、应答。此外，新型的疫苗抗原筛选方法正在帮助发现以前从未认识到的尿路感染疫苗靶位。Vaxign是一个基于网络的疫苗设计程序，它通过反向疫苗学预测新的UPEC疫苗靶位齐。除了Vaxign之外，其他的筛选方法也用于寻找新的疫苗靶位，例如Moriel等同以消减反向疫苗学为基础，通过对3种肠外致病性大肠埃希菌CFT073、536和IHE3034的生物信息分析来预测疫苗抗原。通过这种方法，发现r230种潜在抗原，其中9种对脓毒症小鼠模型有保护作用。不论是已进行的疫苗研究，还是新型的疫苗、佐剂及呈递系统的发现和测试，都使人们对未来研制成功预防尿路感染的疫苗充满了希望。参考文献：C1jFoxmanB.Thee

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