微藻分离及保存

1、1用液体培养基分离培养的方法用液体培养基培养分离的藻种首先要配制培养液,液体培养基通常用消毒海水按常规配方(例如F/2培养基)配制,或者根据不同的微藻采用其专用的培养基配方。分离和培养的工具、器皿要进行高温灭菌。1.1样品系列稀释分离法1.1.1原理在无菌操作的条件下,对分离的样品采用逐步稀释的方法,边稀释,边在显微镜下镜检,直到视野中每滴样品只含1个细胞时,即停止稀释,开始分接培养。1.1.2方法首先在第一个试管中加入要分离的藻液样品,其他试管中加入等量培养液,加入培养液的体积根据分离样品的具体情况而定(如10ml),从第一试管中吸取和培养液同体积的藻液样品(10mL)加到第二支试管中,充分

2、振荡摇匀,此时藻液被稀释了2倍,再用一支新的消毒的移液管,吸取第二支试管中的稀释藻液(10mL)加入第三支试管中,如前振荡,使均匀稀释,此时藻液被稀释了4倍,以后的试管依次采用同样的方法稀释,直到镜检每滴稀释样品中只有1个细胞,可以用这样的稀释藻液进行培养,最终的稀释液种分装到不同的试管中,用棉塞塞好试管,把试管放在有漫射阳光的地方,每日轻轻摇动几次,发现试管中有藻色后进行镜检,如镜检到单种则表示分离成功,此时已达到了分离、纯化的目的,可进行扩大培养。1.1.3应用概况样品系列稀释分离法设备简单,操作简便,工作量小,但是这个技术有很大的盲目性,分离的样品很可能来自两个或更多的细胞,分离的微藻单

3、种不一定是目标种,但可能分离到其他种或新种,尤其对于从天然水域采取水样的初步分离非常适合,而且对于微藻的种类、大小没有限制。1.2微吸管分离法1.2.1原理在无菌操作条件下,用极细的微吸管,在显微镜下把目标藻样从一个玻片移到另一个玻片,采用同样的方法反复操作,直到镜检水滴中只有目标单种为止。1.2.2方法在微吸管的顶端套一条长约8cm的医用乳胶管,分离操作时,用手指压紧乳胶管以控制吸取动作。将分离的水样置于载玻片上,在显微镜下把微吸管口对准要分离的藻细胞,放松手指,藻细胞被吸入微吸管;接着把吸出的水滴放在另一载玻片上,显微镜检查水滴中是否只吸到藻细胞,经过如此再反复操作,直至达到单种分离的目的

4、。然后把分离出的藻细胞冲入预先装有培养液的试管内,放在适宜的光照下培养,试管有藻色后镜检,培养为单种的试管,其他不合格的弃掉。1.2.3应用微吸管分离法的特点是易找到特定的种类,所用的设备也较简单,但操作技术难度较大,往往吸取一个单细胞需要几次至十几次才能成功,而且适于分离个体较大或丝状的藻类,如螺旋藻、骨条藻等,较小的藻类用此方法比较困难。1.3水滴分离法1.3.1原理在无菌操作的条件下,把要分离的藻样用微吸管在玻片上滴成大小合适的小水滴,镜检水滴中只有一个要分离的单种,即可冲入试管培养。1.3.2方法用小烧杯装稀释的藻样,将微吸管插入藻样中,提取微吸管,让多余的藻液滴出,然后把管口与消毒过

5、的载玻片接触,即有一个小水滴留在载玻片上。一个载玻片滴34滴,间隔一定距离,然后在显微镜下观察。若一个水滴中只有一个需要分离的藻细胞(无其他生物混杂),即用移液管吸取培养液把该水滴冲入试管中,试管口塞上棉塞,放在适宜的条件下培养。该分离法的关键是藻样稀释要适宜(稀释至每个水滴约有12藻细胞),水滴大小适宜,以在低倍镜下能看到水滴全部或大部分为宜,并且观察要准确、迅速。1.3.3应用水滴分离法操作简便易行,但具体操作中要注意上面提到的问题。此方法对于藻细胞的大小没有限制,尤其适于分离已在培养液中占优势的种类。2固体培养基分离方法(平板分离法)作为微藻分离用的固体培养基,是在常规的液体培养基中加入

6、一定量的琼脂,并且使其溶解和高温高压灭菌后,通过适当的方法,把要分离的藻样接种在培养基上,通过一定的时间培养,在培养基上长出单个的藻落而达到分离的目的。2.1固体培养基制备和灭菌在常规的液体培养基中加入一定量的琼脂(1.0%2.0%),加热溶解后,分装到三角烧瓶中,置于高压蒸汽灭菌锅器中灭菌,温度121,时间2030min,待培养基冷却到50时,无菌操作倒入到灭菌的培养皿中待用。2.2接种的方法接种在超净工作台上进行,接种的方法有两种。2.2.1喷雾法首先用消毒海水把要分离的藻样进行适当的稀释,装入消毒过的医用喉头喷雾器中,打开培养皿盖,把藻样喷射到培养基平面上,使藻样在培养基表面上形成分散均

7、匀的一层薄水珠。水样稀释到合适的程度是指水样喷射在培养基平面上必须相隔1cm以上有一个藻细胞,否则将来长出的藻落距离太近,不易分离。2.2.2划线法把接种环在酒精灯上灭菌后,蘸取藻样轻轻在培养基平面上做第一次划线34条,把培养皿转动约70角,并把接种环在酒精灯上灭菌,通过第一次划线区做第二次划线。用同样的方法做第三、第四次划线。由于第一次划线接种环上的藻细胞比较多,在第一划区藻细胞可能密集不能分离开,但通过后面的划线可能分离出单独的藻类群落。2.3培养培养基上接种后,放在适宜的光照下培养,经过一段时间的培养,在培养基上长出藻类群落,通过显微镜检查后,用纤细的解剖针把单个的目标藻落连同一小块培养

8、基取出,移入装有培养液的试管中培养,待试管中有藻色后镜检,如无其他生物混杂,达到了单种分离的目的。2.4固体培养基分离法的应用用琼脂做的固体培养基的分离方法并不适合所有的微藻,大多数的绿藻都可以在这种培养基上生长,从而达到单种分离的目的,但有的微藻在琼脂培养基上生长较差,甚至不能生长,如有些金藻类和硅藻类,这可能是琼脂培养基的表面张力较大的缘故,可以在培养基中加入100500g/L的表面活性剂可以促进生长。一般的培养基中营养盐所用的氮盐为硝态氮,以尿素代替硝酸钠,球等鞭藻3010、3011、湛江叉鞭藻、牟氏角毛藻在琼脂培养基上可以正常生长,这几种单细胞藻具有尿素酶,能分解尿素作氮源,而利用硝酸

9、钠作氮源,需要将硝态氮还原成铵态氮,这几种藻含有的异养菌较少,又由于处于无菌的环境中,所以藻种在氨态氮中能正常生长,而在硝态氮中不能正常生长。固体培养基中琼脂的加入量,要根据琼脂的质量灵活使用,培养基太硬,影响营养盐的缓释,水分易失去,不利藻落的生长,培养基太软不利于划线,容易划破培养基,影响操作。固体培养基分离法工作较繁琐,工作量大,但分离单种成功的几率较高。3、 藻种保存1保存方法1.1继代保存继代保存是指把藻种接种在单一固体、液体或固-液双相培养基上,在低温(是指温度控制在58之间)、弱光(通常指在冰箱内装1支8W的日光灯照明)条件下培养,一代一代传下去以延续“种族”的1种方法,接种1次

10、可保藏半年到1年。1.1.1培养基的制备液体培养基通常用消毒海水按常规配方(例如F/2培养基)配制；固体培养基即平板培养基,作为保藏藻种用的固体培养基,其营养物质的浓度应按常规配方增加1倍,用合适的仪器分装后,加入适量琼脂,培养液经高压蒸汽灭菌后,取出,试管应倾置成斜面,三角烧瓶则平放,冷却后即成固体培养基。1.1.2接种要保藏的藻种,可接种在固体或液体培养基上,也可以在固体培养基上加入比其体积多两倍的培养液,然后在液相接种少量藻液,称双相培养。1.1.3培养和保藏液体或双相培养基保藏的藻种,接种后可直接放置低温、弱光的条件下保藏,也可在适宜光照条件下培养34d后再移置低温、弱光条件下保藏。而

11、仅用固体培养基保藏的藻种,接种后应首先放在适宜的光照条件下培养,待藻细胞生长繁殖达到较高密度,在平板上可见明显的条状或块状的藻细胞群,再移置低温、弱光的条件下保藏。1.1.4研究及应用概况液体培养基简便易行,但保存期短；固体培养基保存期较长但容易干涸,而双相培养既可避免干涸问题,又能保存更长时间,保存效果比单一培养基好。而且,还可通过液相中有无游动胞准确地检查藻的生存与否。由于简便易行,目前在生产和科研实践中,保存藻种最常用的仍是液体培养基。作为目前一般实验室保存藻种的常规方法,继代保存简便易行,设备简单,但工作比较琐碎,耗费时间和精力。在多次的移接过程中,稍有疏忽就会使藻种污染上杂藻、细菌或

12、原生动物,使保种失败,而且还会使藻种逐渐老化。为避免这种情况,每1种藻类的保存,至少要保存3种不同年龄的藻种,最早的藻种用于传代,其余2种以备培养发生意外时急用。1.2固定化保种固定化细胞(immobilizedcells)是指将游离细胞包埋在多糖或多聚化合物制成的网状支持物中,进行无菌培养。固定化保种原理固定化细胞培养是最接近自然状态的培养方法之一,细胞处于静止或相对静止状态,而培养液为流动态。由于微藻细胞受到固定载体的束缚,影响细胞代谢过程,从而抑制细胞的生长和分裂。固定化后的各种微藻在固定化载体内进行细胞分裂并形成大小不一的藻落。当藻落达到一定密度后,细胞的生长就逐渐停止。有些种类固定化

13、细胞会逐渐死亡解体,而另一些种类,若定期更换培养液和保持合适的培养条件,细胞仍可保持旺盛活力不会死亡。因此,不同的微藻固定化保存的时间长短不同。1.2.2固定化方法在固定化培养中,固定细胞的固定剂主要是一些多糖和多聚化合物,如褐藻酸盐、琼脂、琼脂糖、角叉藻聚糖、明胶、聚丙烯酰胺等。现以褐藻酸盐为例来说明固定化保种的方法。将经过消毒的褐藻酸钠(2.5%,w/v)与藻液(浓度约1105cell/mL)按4:1的比例充分混匀,用9号针头的注射器以6mL/min的速率滴入2%的CaCl2溶液中,边滴边摇动。约30min后形成固化的褐藻酸钙胶珠,从而使藻细胞得以固定。将形成的褐藻酸钙胶珠用消毒海水洗涤两

14、次,置于100mL的三角烧瓶内保存培养。1.2.3研究及应用概况从1978年以来,固定化技术就被用来作为延长光合细胞寿命的一种重要手段。现在,对微藻的一些试验表明,固定化技术可作为微藻种质保存的重要方法之一。由于各种藻的特性不同,固定化保存的时间长短也不尽相同。Tamponnet等报道了固定化纤细裸藻存活2年；Hertzberg等报道了固定化的三角褐指藻(Phaeodactylumtricormutum)保存18个月,中肋骨条藻(Skeletonemacostatum)保存6个月,但矮小海链藻(Thalassiosirapseudonana)和贺氏钙板金藻(Emilianahuxliyi)仅能

15、保存3个月,而蓝螺藻(Scrippsiellatrochoidea)固定化培养1个月后就会死亡；马志珍等通过固定化方法保存三角褐指藻(Phaeodactylumtricormutum)的存活时间可达2年左右。固定化保种的设备较为简单,培养保存时间较长,活化复苏快,一般经34d的延缓期,最多56d就能复苏生长,但固定化程序较复杂,需要细心操作。另外,大多数微藻在培养后期常会从胶珠中溢出,有的胶珠还会融解,这是今后工作的重点和难点之一。而且,现有的资料表明,某种固定化方法只适用一定种类的微藻,对同一种固定化方法,不同种类的微藻会有不同的反应,其原因是复杂的,探讨其内在机制还需要做更深入、广泛的研究

16、。也只有进行更广泛的试验后,才能确定是否能用固定化技术来作某种微藻的种质保存,这就给固定化保种技术的推广带来了一定的困难。1.3超低温保种技术所谓超低温即指液氮低温(-196),以区别于其他低温概念的冰箱温度(4-40)和干冰温度(-79)。微藻的超低温保存研究起步较晚,目前普遍采用2步冷冻法,即慢速降温进行冷适应,然后投入液氮中保存。并且,一般进行快速解冻活化复苏效果较好。但由于微藻的种类很多,适宜的保存条件各异,如何因种而异,找出不同微藻的超低温保种方法,应是今后努力研究的目标。超低温保存的基本原理在液氮低温-196下,生物体的物质代谢和生长活动几乎完全停止,可是它们仍处于可逆的成活状态。

17、通过添加一定的抗冻保护剂,防止细胞在降温冰冻过程中严重脱水和低温休克,避免细胞内冰晶的形成,采用适当的冰冻速度,使细胞安全地越过冰晶形成危险区(从细胞介质或原生质的冰点到-60),进入玻璃化状态,以达到长期保存的目的。所谓玻璃化是指液体转变为非晶态(玻璃态)的固化过程。玻璃态固体分子之间的关系和液态无明显变化,水分子停止运动,保持原来的无序状态,形成坚硬、均匀的团块结构。玻璃化的细胞不会出现原生质的严重脱水,细胞结构完整,解冻后即可恢复生长繁殖能力。1.3.2超低温保存的基本方法I降温液氮法II玻璃化低温保存玻璃化是近年来细胞保存的1种新的方法,比冻结固化方法引起的结构变化要小,因而是1种较理

18、想的低温保存途径。玻璃化有2条途径:一是极大地提高冷却速率;另一条是增加溶液浓度。常用的有沉浸法、喷溅法和镜面接触法。沉浸法是将生物样品快速地浸入(或弹入)低温液体中。喷溅法是将低温液体经过喷嘴高速喷溅到生物样品上,或是将生物样品的悬浮液高速喷溅进入低温液体中,以达到样品被快速冷却的目的。镜面接触法是将生物样品快速地与某固体镜面接触,而此固体镜面预先被冷却至77K或更低温度。为了达到高的冷却速率,要求固体镜面具有高的导热系数和比热,常用的有铜、银、蓝宝石等。1.4浓缩低温保存技术浓缩低温保存法是将藻液高密度培养后,采用物理、化学的方法浓缩1000倍左右，再低温保存。国外自80年代末开始就有对海

19、洋经济微藻的浓缩方法和低温保存方法进行研究,取得了不少的研究成果，其中美国、英国和日本已有相应的产品(微藻浓缩细胞或称“藻膏”)问世。蒋霞敏等将小球藻和球等鞭金藻3011(IsochrysisgalbanaPark)浓缩后，在57的冰箱中保存13个月后恢复生长获得好于常温的效果。孙建华、王如才（1993）对小新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)、球等鞭金藻的浓缩和保存方法进行了研究,浓缩藻液在14的低温下加保护剂SAMs保存3个月,复苏后效果良好。浓缩低温保存多用于海洋微藻。微藻浓缩液的生产,可以使海洋微藻的生产与使用保留一定的时间差。但相对保存时间较短，海洋微藻的抗逆原理还有

20、待作更多的研究和探讨。1.5冷冻真空干燥保存法冷冻真空干燥保存法是在极低温度下（-70左右）快速冷冻，然后在极低温度下真空干燥，使藻种的新陈代谢活动处于高度静止状态。19世纪末Fkral与Mudd创立的冷冻真空干燥法是迄今公认最佳的藻种保存法,严珍等选择脱脂牛奶作为保护剂，将藻液放入安瓿管中，冷冻、干燥并抽真空，火焰熔封。在低温避光处保存，预计最大保存年限为18年。冷冻干燥保存法优点是微藻复苏效果好，保藏期内可避免其他杂菌污染，便于携带运输，易实现商品化生产；其缺点是操作繁琐、对设备要求高等；应用前景十分光明。1.6低温甘油生理盐水法低温甘油生理盐水法是对甘油原液保存法的改进。加入生理盐水适当

21、降低了甘油的高渗作用，更有利于藻种的保存。在藻液中入一定的甘油作保护剂,同时加入一定的生理盐水,混匀后直接放置在-200.5冰箱放置保存。保存时间长，一般3年左右。 1.7其他平板保藏及斜面保藏法、液体培养基保藏法、固液双相继代保藏法和甘油管保藏法，保藏方式如图2-1。平板保藏、斜面保藏和液体培养基保藏时，应该放在弱光处，平均每隔23月转接一次。固液双相保藏的具体步骤:先将固体培养基灭菌，将灭菌的培养基放置在50 0C的烘箱中冷却，向冷却后未凝固的培养基中注入适量藻液混匀，待培养基凝固后加入灭菌的液体培养基液封，将培养基放置在弱光、阴凉处保藏，此种保藏方式能保藏1年以上。甘油管保藏时，甘油的体积比为10 %-25 %，保藏在-20 0C的冰箱中，甘油管一般能保藏1年左右。从理论上讲,以上方法均可用于微藻的保存,但由于所需试验系统比较复