基因组学2015课件专题

1、1siRNAs and miRNAs: Themes in Common6非编码RNA 主要种类microRNAs (miRNAs)small interfering RNAs (siRNAs)Piwi-interacting RNAs (piRNAs)Long noncoding RNA(lncRNA)small nuclear RNAs (snRNAs)small nucleolar RNAs (snoRNAs)tRNA、rRNA5Science 296 1260 (2002)非编码RNA的定义非编码RNA( ncRNA)是指各种不编码蛋白质的RNA。其中包括多种功能已知的 RNA，如tR

2、NA， rRNA;还包括未知功能的RNA。这些RNA的共同特点是从组上转录而来，但是不翻译成蛋白， 在RNA 水平上就能行使各自的生物学功能.4非编码RNA的定义、种类中心法则RNA的发展历程3John L. Rinn and Howard Y. Chang., Annu. Rev. Biochem., 2012主要内容1, 非编码RNA的定义、种类2, siRNA的功能3, miRNA的功能4, lncRNA(长链非编码RNA)的功能5,其它非编码RNA（diRNA、piRNA）的功能2表达调控的新视角-非编码RNA22. siRNAs发现历程1990年，Rich Jorgensen 在矮牵

3、牛花中发现转沉默（共抑制）1995年，Sun Guo 注入反义RNA及正义链RNA抑制线虫par-1的表达； 三年后， Fire和Mello发展了通过RNAi 进行线虫敲除的策略(PTGS)。此后，又在果蝇、锥虫、涡虫、无脊椎动物、脊椎动物、植物、真菌、斑马鱼及哺乳动物几乎所有的 物细胞中发现了siRNA介导的RNAi现象。2001年Elbashir等 Nature上首次通过21个核苷酸的siRNA地在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉默。近年来，显微注射，枪，工程诱导RNAi也成为反向遗传学研究中的重要工具。121. siRNA概念siRNA ：是一种小RNA（21-25nt），由RNAas

4、e 中对双链RNA具有特异性的酶-Dicer 而成。每一条链各有一个5磷酸基末端与一个3羟基末端，这种小RNA特异性的识别靶并发挥转录水平或转录后水平的沉默效应，最终高效特异的阻断的表达，甚至能达到敲除的效果。11siRNA的功能1. siRNA概念2. siRNA发现历史3. siRNA造成的RNAi机制4. siRNA的分类及作用机理10AGO蛋白的结构域及空间结构9Argonaute由siRNA介导的RNAi途径中， Argonaute蛋白可以用内切核酸酶活性来沉默mRNA靶，这种过程被称作切割。 Argonaute蛋白在进化过程中演变出了各种亚科蛋白。这些亚科蛋白可以识别各种不同类型小

5、RNA，从而在各种小RNA沉默途径中发挥作用。RISC1. TRBP能够招 募Dicer复合体miRNA形成RISC Ago22. PIWI结构域具有RNaseH样的折叠情况， RISC中的酶切割活性中心3. siRNA是RISC完成特异性切割作用的向导.Dicer 蛋白的结构域及空间结构Dicer酶是RNaseIII型中的蛋白酶，可特异识别并切割以各种方式进入到细胞内的dsRNA. Dicer在RNAi及相关途径中起重要作用，一方面可以切割外源dsRNA成为 siRNA来介导RNAi对外来核酸的抗性，另一方面可以内源序列成miRNA来调节体内表达，保证生物体的正常生长发育。Dicer主要由R

6、NA解旋酶结构域、PAZ结构域、RNase结构域和dsRNA结合区结构域。3RISC（RNA-induced silencing complex ）RISC由siRNA、 解旋酶、ATP、核酸 内切酶、核酸外切酶 等多种成分组成。活 化的RISC在单链 siRNA引导下识别互 补的mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导 链中心所对应的靶基 因位置切割靶mRNA， 最后可能再被核酸外 切酶进一步降解，从 而干扰表达。18效应阶段siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing comp

7、lex，RISC)，并通过碱基配对结合到靶的序列上。 RISC RISC binding targeted RNA17起始阶段第一步（起始阶段）是较长ds RNA在ATP参与下被特异核酸酶Dicer切割成2123nt的和反义链组成的小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA）。siRNA的两条单链末端为5磷酸和3羟基，且3端均有3个突出的核苷酸。16RNAi机制中siRNA发挥的沉默作用起始阶段效应阶段扩增扩散阶段15 一方面结合mRNA的产物以siRNA作为引物 一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA. 以mRNA为模板 在依赖RNA的RNA聚合酶siRNA的

8、双链解开变成单链 并和某些蛋白作用下出mRNA的互补链。新的长形成复合物。此复合物同与siRNA互补的 链dsRNA同样可被切割生成大量的次级mRNA结合 使mRNA被RNA酶裂解。siRNA。次级siRNA又可进入-切割的循14环过程 进一步放大RNAi作用。3. siRNA造成的RNAi机制RNA interference（ RNAi） 在进化过程中高度保守、由双链RNA（dsRNA）诱发并导致 同源mRNA高效特异性降解的现象。34ta-siRNA的产生及作用过程Liang W Long M and Yijun Q Plant Physiology July 30 20124.trans

9、-acting siRNAs (ta-siRNAs) Allen等(2005)对拟南芥miR173靶的序列分析发现，靶编码一系列siRNA，并且都含有siR255及序列相似的siRNA，而siR255又类似miRNA一样反式作用于其下游靶PPR(pentatricopeptide repeat)类蛋白的，因此这类由miRNA并能产生siRNA的分别被命名为trans-acting siRNAl（TAS1）。反式作用干扰小RNA是新近在植物中发现的依赖于miRNA、长度为21个碱基的小RNA，对植物的生长发育过程具有重要的表达调控功能。tasiRNA的生物需要有miRNA介导的非编码转录产物的切

10、割。hc-siRNA作用机制1. 产生 hc-siRNA在转座子等重复DNA序列区域产生。2. 出核 hc-siRNA主要存在于细胞质中，并且大部分以游离的双链形式存在3. 变构 AGO4在HSP90蛋白的帮助下结合双链siRNA， 然后通过其核酸内切酶活性切割并降解其中一条链， 形成成 结合单链siRNA的AGO4效应复合体。siRNA的结合很可能导致AGO4构象发生变化， 出其核 信号，细胞因此可以选择性的识别并转运成AGO4/siRNA复合体至细胞核内。4. 入核 与AGO4蛋白结合形成效应复合体。AGO4/siRNA复合体可进一步招募DNA甲基转移酶DRM2等组分，特异性地识别同源DN

11、A序列并介导甲基化修饰。意义hc-siRNA的产生和最终 功能行使都在细胞核中 进行，了以前人们 认为的RdDM通路完全 在细胞核内进行的成见。Ruiqiang Ye ，Molecular Cell, 20124. siRNA的分类及作用机理hc-siRNAs-Heterochromatic siRNAsphasiRNAs-Phased siRNAstasiRNAs-trans-acting siRNAs21siRNAs介导的RNAi作用特点：1. 高效性2. 浓度依赖性3. 高特异性4. RNAi对细胞调控机制的影响性：RNA干扰在有效地沉默靶 的同时，对细胞本身的调控系统没有影响5.高稳定

12、性6. 遗传性7. 放大效应8. 作用广泛性20扩增扩散阶段(放大效应) 模板 靶mRNA切割片段 引物 siRNA 产物 长链dsRNA 依次循环新的长链dsRNA同样可被Dicer切割、降解生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入-切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。siRNA在RNAi途径中发挥重要的作用，但随着研究的深入发现的siRNA类型越来越多，发挥作用的方式也多样性。19RNAi途径中siRNA作用 movie5canonical miRNAs1. 水稻中，有6个DCL蛋白（OsDCL1、OsDCL2a/b、OsDCL3a/b 和OsDCL4），2. OsDCL1对于

13、水稻miRNA的产生有重要作用.几乎所有 miRNA都是由DCL1剪切而来。3. 检测来源于反向重复结构的siRNA数量变化发现，在dcl1 突变体中，siRNA数量没有明显变化，但在dcl4突变体中，来源于此结构的21 nt siRNA几乎完全消失，表明OsDCL4对于这种siRNA的产生有重要作用。Bin Liu Plant Physiology 2005A2. miRNA的cmiRNAs-Canonical miRNAslmiRNAs-long miRNAsnat-miRNAs-Natural cis-miRNAs29近年来被鉴定的miRNAs越来越多至今超过17000 miRNAs已被

14、发现28microRNA的发现Victor AmbrosGary Ruvkun 第一个被发现的miRNA (lin-4)由哈佛大学的Victor Ambros发现的（1993） 第二个被发现的miRNA（let-7）由哈佛大学的博士后Frank Slack (Ruvkun）发现的（2000)271. microRNA概念及发现MicroRNAs（miRNAs）是在物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA， 其大小长约2025个核苷酸。通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。26miRNA的功能1. miRNA概念及

15、发现2. miRNA的3. miRNA介导靶沉默作用机制4. miRNA产生特点5. miRNA功能研究思路256 第一种是切断靶的mRNA。miRNA与靶标 完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常类似，最后切割靶mRNA植物中，大部分microRNA都以这种方式， 靶mRNA断裂后，无poly（A）的的3端加上多个U并很快降解，含poly（A）的能稳定存在一 段时间(如拟南芥miR-171）。36microRNA对靶的抑制miRNARISC对靶 mRNA的抑制主要取决于它与靶 转录体序列互补的程度，有3种方式。结合抑切割抑制制:切割or 抑制35343. miRNA介导靶沉默机制33n

16、atural antisense miRNAs (nat-miRNAs)nat-siRNAs1 靶标是位于水稻细胞DNA反向链上它们直接面对的2 这类微RNA没有存在于常见的研究用植物拟南芥中，只在叶植物中发现了这种新型的小RNA。Cheng Lu,PNAS,2008long miRNAs (lmiRNAs)1. lmiRNAs由另一个Dicer成员，DCL3切割产生，并与AGO4亚蛋白形成RISCs。2. lmiRNAs与AGO4的特异性互作不仅取决于lmiRNAs的5 末端核苷酸，而且依赖于上游lmiRNAs的产生机制。3. lmiRNAs不是在转录后水平调控Liang Wu，Molecu

17、lar Cell,201075.2 导入外源片段竞争miRNA，使其不能结合内源性靶Artificial target mimics of miR156WT35S:MIMI156b42Franco-Zorrilla JM, Nat Genet 20075.1 改变植物体中miRNA的表达量WT35S:miR156bThe 35S:miR156b plant, which is about 7 months old, has many more, but smaller, leaves41Schwab R, Dev Cell. 20055. 植物miRNA的功能研究思路miRNA的正常表达是植物

18、正常生长发育所必需的，如何研究miRNA对靶标的调控作用？研究思路5.1 改变植物体中miRNA的表达量。5.2 导入外源片段竞争miRNA，使其不能结合内源性靶。5.3 通过转改变植物中靶mRNA 的序列使其具有抗miRNA降解的能力。404 miRNAs产生特点1 miRNA前体通过RNA聚合酶II转录生成，具有mRNA的结构特征。2 具有多顺反子结构即一条pri-miRNA包含多个成熟miRNA的信息。3 miRNA可来源于外显子,也可来源于内含子和非编码序列。4 miRNA在组座位上分布，处于同一族的miRNA常共表达。5 对于同一miRNA，其功能常具有互补作用。6 不同miRNA可

19、同时调节同一靶mRNA。39 第三种是结合抑制具有以上两种作let-7用模式：当与靶标基因完全互补结合时， 直接靶向切割mRNA； 当与靶标全互补结合时，起调节表达的作用。Target knockdown38 第二种是抑制靶的翻译作用时与靶标不完全互补结合，进而阻遏翻译而不影响mRNA的稳定性，这种miRNA是目前发现最多的种类(线虫lin- 4).在动物体内，大部分miRNA不能与靶的转录体完全配对，故被认为主要通过翻译抑制的方式来调控靶。在植物中极少数的microRNA通过此方式来抑制靶。378作用机理Archetype I as signals, lncRNA expression ca

20、n faithfully reflect the combi-natorial actions of transcription factors (colored ovals) or signaling pathways to indicate gene regulation in space and time.Archetype II as decoys, lncRNAs can titrate transcription factors and other proteins away from chromatin or titrate the protein factors into nu

21、clear subdomains. A further example of decoys is lncRNA decoy for miRNA target sites.Archetype III as guides, lncRNAs can recruit chromatin-modifying enzymes to target genes, either in cis (near the site of lncRNA production) or in trans to distant target genes.Archetype IV as scaffolds, lncRNAs can

22、 bring together multiple proteins to form ribonucleoprotein complexes. The lncRNA-RNP may act on chromatin as illustrated to affect histone modifications. In otherinstances, the lncRNA scaffold is structural and stabilizes nuclear structures or signaling complexes.2.lncRNA作用机制47Long Noncoding RNAs定义

23、长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)长度200个核苷酸缺少特异完整的开放阅读框序列保守性差（物种特异性）表达量低和组织特异性无蛋白质编码功能461.lncRNA的发现及概念Long Noncoding RNAs ，起初被认为是 组转录的“噪音”，是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默， 组印记以及染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内 等多种重要的调控过程，这些调控4作5 用也开始引起人们广泛的关注。lncRNA(长链非编码RNA)的功能-组的暗物质1. lncRNA的发现及概念。2. lncR

24、NA作用机制。3. lncRNA作用特点。445.3 通过转改变植物中靶mRNA的序列使其具有抗miRNA降解的能力改变靶重要碱基（同义突变），miRNA不能识别靶。439 lncRNA在多个水平上参与调控lncRNA可通过多种途径、在多个水平调节的表达。（1） 转录前水平-甲基化修饰、组蛋白修饰等（2） 转录水平-干扰转录因子与启动子结合等（3） 转录后水平- 作为小RNA的前体，以小RNA发挥切割靶的作用。（4） 蛋白水平-改变蛋白质活性或亚细胞等。54 种类、数量、功能都不明确在20世纪80年代，人们首次鉴定出lncRNAs。当前人们已经在多种哺乳动物组织中研究了大约100种lncRNA

25、s 。虽然近年来关于lncRNA的研究进展迅猛，但是绝大部分的lncRNA的功能仍然是未知的。53相比蛋白编码,更严格的功能限制大多数的lncRNAs在组织分化发育过程中， 都具有明显的时空表达特异性， 人 小鼠的1300个lncRNAs进行研究，发现在脑组织中的不同部位，lncRNAs具有不同的表达模式。52进化速度快，序列的不保守性与编码 相比， lncRNA序列保守性差，进化快，但启动子区域相当保守。 同样可以结合转录因子，局部染色质组蛋白同样具有特征性的修饰方式与结构特征。分析发现，哺乳动物体内lncRNA达1 000多种， 可通过蛋白质编码序列转变为非编码序列后转录而得到，或由去除了

26、外显子的 序列转录而来， 其表达具有组织和时空特异性。与编码蛋白质的相比，lncRNA序列的保守性较差。513 lncRNA作用特点 lncRNAs通常为长度200个核苷酸的RNA。具有mRNA样结构，经过剪接，具有polyA尾巴与启动子，多数由RNA聚合酶转录，发育过程中有动态的表达与不同的剪接方式，比编码可塑性更大。50植物中已的lncRNA作用途径49102. repeated-associated siRNA (rasiRNA)piwi-interacting RNAs重复序列相关小干扰RNA前体由重复元件编码的，大部分都是转座子或反转座子序列，编码的小RNA 没有发夹结构，研究发现，

27、 rasiRNA 在异染色质重塑，稳定方面起作用。（RasiRNAs are called piRNA since 2007）piRNA因其可与名为PIWI蛋白的Argonaute蛋白相结合而得名。piRNA是单链非编码小RNA,其长度一般为2433nt，通过特异性地与Piwi蛋白结合而发挥生物学作用。目前的研究表明, piRNA主要存在于哺乳动物的生殖细胞和干细胞中 通过与Piwi亚 蛋白结合形成piRNA复合物(piRC)来调控沉默途径。这些研究结果表明小 RNA在物DNA双链断裂修复过程中具有保守的重要功能，并为人们对DNA双链断裂修复机理的认识提供了 性的新概念。59diRNA的产生依赖于PI3激酶ATR，RNA聚合酶IV和DCL（Dicer-like），其产生后被AGO2蛋白招募而起作用581. diRNA (DSB-induced small RNA)diRNAs大小