实时荧光定量PCR2016.05.20

1、刘亭刘亭2016.05.252016.05.25内容内容常规常规PCRPCR：扩增：扩增DNADNA，借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析，借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析变性变性退火退火延伸延伸Y0 2 4 8 16 Y0 2n扩增扩增DNADNA，利用荧光信号的变化实时检测，利用荧光信号的变化实时检测PCRPCR扩增反应中每一个扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析Y0 2 4 8 16 Y0 2n扩增曲线背景期对数增长期线性增长期平台期 荧光嵌合荧光嵌合法（法（非特异性）非特异性）S

2、YBR Green SYBR Green I I 荧光探针荧光探针法（法（特异性特异性）TaqMan probeTaqMan probeCycling probeCycling probeReal Time Real Time PCR PCR 的荧光的荧光化学检测化学检测原理原理非特异性的荧光嵌合法非特异性的荧光嵌合法 SYBR Green ISYBR Green I SYBR Green ISYBR Green I是一种能够结合于所有双链是一种能够结合于所有双链DNADNA小沟中的荧光染料，小沟中的荧光染料，SYBRSYBR与与PCRPCR合成合成DNADNA双链结双链结合后，发射荧光信号，

3、而游离的合后，发射荧光信号，而游离的 SYBR SYBR 不会发射荧光信号，因此荧光信号的增加与不会发射荧光信号，因此荧光信号的增加与PCRPCR产物产物的增加完全的增加完全同步同步优点：简单易行，成本优点：简单易行，成本较低较低缺点：与缺点：与非特异性产物结合非特异性产物结合，不能进行多重，不能进行多重PCRPCR适用：不同样本同一基因适用：不同样本同一基因相对表达量分析相对表达量分析特异性荧光探针法特异性荧光探针法 TaqMan TaqMan probe probe Taqman 探针是一段与目的基因配对的DNA序列，5端加荧光物质，3端加淬灭物质，完整探针5端的荧光物质被3端淬灭物质抑制

4、，不发荧光，当PCR合成DNA，退火时探针和DNA配对，延伸时，由于DNA聚合酶也有核酸外切酶活性，将探针分解， 5端荧光物质游离出来，发出荧光，检测荧光强度，表征PCR扩增的DNA量。优点：特异性强，能进行多重优点：特异性强，能进行多重PCRPCR缺点：需设计特异性探针，成本较高缺点：需设计特异性探针，成本较高适用：区别同源性高的序列，适用：区别同源性高的序列，SNPSNP解析等多重解析等多重PCRPCR检测检测阈值（ Threshold ）：在扩增曲线指数增长期设定的荧光检出界限（第315个循环的荧光信号标准偏差的10倍）C(t)值（Cycle of threshold）：荧光信号（扩增产

5、物）到达阈值时所经过的扩增循环次数阈值C(tC(t) )值值 18.12 +/- 0.0418.12 +/- 0.0418.12 +/- 0.04C(tC(t) )值值18.12 +/- 0.04Real Time Real Time PCR PCR 的数学定量的数学定量原理原理绝对定量相对定量Real Time Real Time PCR PCR 的数学定量的数学定量原理原理初始DNA量越多，越早达到阈值，扩增曲线越早起峰，Ct值越小经数学理论证明，初始DNA量的对数值与循环数/Ct呈反比线性关系肿瘤正常绝对绝对定量定量将已知浓度的标准品进行梯度稀释，进行Real Time PCR,会得到一

6、系列等间隔的扩增曲线。以它们的Ct值作横坐标，初始DNA量的对数值为纵坐标，作图得到标准曲线，未知浓度的样品进行Real Time PCR,得到Ct值，代入标准曲线，可以样品的初始DNA量。10410310610510210荧光强度-循环数曲线初始DNA量对数-Ct循环数标准曲线绝对定量通过标准曲线确定初始DNA/RNA基因拷贝数或浓度，通常用于病毒，病原菌的定量检测即转基因食品食品的检测。相对相对定量定量比较不同样本之间基因表达量的高低变化，需要做相对定量。相对定量引入内参基因，即维持细胞基本代谢活动所必需的基因，其表达量在不同的细胞里基本一样，在扩增目的基因的同时扩增内参基因，用不同样本的

7、目的基因的扩增量与各自内参基因的扩增量的比值对目的基因表达量进行均一化后，再比较高低，可以对不同样本间细胞起始数，RNA提取效率，基因扩增效率的不同进行矫正。定性分析定性分析: :病毒和病原菌检测;单核苷酸多态性（SNP）检测;物种鉴定定量分析定量分析: :绝对定量:病毒和病原菌定量;基因拷贝数分析;转基因定量分析相对定量:基因表达基因表达量分析量分析基因表达的中心法则基因表达的中心法则SYBR green 1 的相对定量法：一、实验设计，材料处理，取材冻存二、目的和内参基因的选择及引物设计三、准备试剂与耗材，预约仪器四、RNA提取，质量与浓度检测，反转录成cDNA五、按反应体系准备样品六、上

8、机设定反应条件，运行程序进行反应七、溶解曲线分析荧光信号产生的特异性八、获得数据，计算分析结果并做图对照组Control处理组Drug112h重复1重复2重复30h3h6h12h重复1重复2重复33h6h一一 实验设计实验设计，材料处理，取材冻，材料处理，取材冻存（存（-80-80）对照组对照组处理组处理组0h#1#2#33h#4#5#6#7#8#96h#10#11#12#13#14#1512h#16#17#18#19#20#21二二 目的和内参基因的选择及引物设计目的和内参基因的选择及引物设计目的基因的选择：目的基因的选择：根据实验目的内参基因的选择：内参基因的选择：维持细胞基本代谢活动所必

9、需的基因，如GAPDH，Actin，18S rRNA等通过查文献或实验筛选引物设计注意事项：引物设计注意事项：引物设计软件 Oligo 7 三三、准备试剂、准备试剂，耗材，预约仪器，耗材，预约仪器试剂：RNA提取试剂盒，cDNA反转录试剂盒（21次反应），SYBR mix（ 212次反应）等耗材：枪头，EP管等（无RNase处理），96/384孔版，透明薄膜，冰及冰盒等仪器：枪，离心机，Nanodrop核酸浓度测定仪，核酸电泳仪，荧光定量PCR仪等四、四、RNARNA提取，质量与浓度检测，反转录成提取，质量与浓度检测，反转录成cDNAcDNA针对样品选用一款合适的RNA提取试剂盒取相同量的组织

10、或细胞提取总RNA提取的总RNA常混有基因组DNA，可以通过DNase处理去除或跨内含子引物设计避免基因组DNA扩增RNA电泳检测降解情况Nanodrop测定RNA浓度和纯度（OD260/2802，OD260/2302）取相同量的RNA（如1ug）做反转录RNA易降解，而cDNA可于-20保存很久五、按反应体系准备样品五、按反应体系准备样品上述cDNA需要进行稀释，稀释倍数实验摸索（使内参Ct约20）每个样品做2个技术重复，事先设计好样品在96孔板上的排列先把稀释好的cDNA加到96孔板，再加混好的SYBR mixture,primer,H2O加入96孔板，盖上透明薄膜，离心后上机反应体系：内

11、参42目的42Template cDNA4uL2SYBR mixture10uL420uL420uLForward primer0.5uL21uL21uLReverse primer0.5uL21uL21uLH205uL220uL220uLTotal20uL内参目的1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 67 7 8 8 9 9 10 10 11 11 12 1213 13 14 14 15 15 16 16 17 17 18 1819 19 20 20 21 21 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 67 7 8 8 9 9 10 10 11 11 12 1213 13 14 1

12、4 15 15 16 16 17 17 18 1819 19 20 20 21 21 六、上机设定反应条件，运行程序进行反应六、上机设定反应条件，运行程序进行反应参考SYBR green 1 Kit 的说明书预变性：95 ,30s ,20 /s 1 cyclePCR反应：95 ,5s ,20 /s 60 ,20s ,20 /s 40 Cycles溶解曲线分析：95 , 0s, 20 /s 72, 15s, 20 /s 95, 0s, 0.3 /s 七七、从溶解曲线确认、从溶解曲线确认PCRPCR反应的反应的特异性特异性溶解曲线的一次曲线溶解曲线的负一次曲线微分曲线PCR反应结束后，扩增产物呈双

13、链，具有较高的荧光信号强度，此时，将PCR反应液的温度渐渐升高，DNA双链渐渐打开，嵌入DNA双链中的SYBR Green 数量减少，荧光信号强度渐渐降低，当双链DNA解链一半时，荧光信号强度急剧下降，此时的温度即溶解温度（Tm值），对于某一特定的PCR扩增产物，其值是固定的。八、八、获得数据，计算分析结果并做图获得数据，计算分析结果并做图样品样品内参内参Ct目的目的Ct相对表达量相对表达量120.15120.12220.13220.14319.88319.99420.45420.21519.45519.70Power(内参Ct-目的Ct，2)谢谢关注，欢迎交流讨论！谢谢关注，欢迎交流讨论！常

14、规常规PCRPCR：扩增：扩增DNADNA，借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析，借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析常规常规PKPK实时实时PCRPCR 实时荧光定量PCR 常规PCR能进行定量或定性分析灵敏度高，精确度高不需要电泳分析，省时，安全，不易污染需要荧光定量PCR仪，荧光染料等，成本较高只能进行半定量或定性分析灵敏度低，精确度低需要电泳分析，费时，不安全，易污染只需要普通PCR仪与PCR试剂，成本较低各种荧光检测方法比较SYBR greentaqmanCycling 优点缺点适用范围Real Time Real Time PCRPCR定量定量的数学原理的数学原

15、理理想的理想的PCRPCR反应：反应：Y Yn n = Y= Y0 02 2n n非理想非理想的的PCRPCR反应：反应：Y Yn n = Y= Y0 0(1+Ex)(1+Ex)n n方程式两边同时取对数得方程式两边同时取对数得: : logYlogYn n = log= logY Y0 0(1+Ex)(1+Ex)n n整理整理方程式得方程式得: :logYlogY0 0 = =-log(1+Ex)-log(1+Ex)n n + logY + logYn n将将CtCt和和Y YC Ct t带入带入上式得：上式得：logYlogY0 0 = =-log(1+Ex)-log(1+Ex)Ct Ct

16、 + logY+ logYCtCtn：扩增反应的循环次数Yn：第n次循环后的产物量Y0：初始DNA量Ex：扩增效率初始初始DNADNA量量的对数值与循环数的对数值与循环数/Ct/Ct呈反比线性关系呈反比线性关系定性分析定量分析绝对定量相对定量病毒和病原菌检测病毒和病原菌检测单核苷酸多态性单核苷酸多态性/SNP/SNP检测检测物种鉴定物种鉴定病毒和病毒和病原菌定量病原菌定量基因拷贝基因拷贝数分析数分析转基因定量分析转基因定量分析mRNAmRNA表达量分析表达量分析Cycling probeCycling probe利用Cycleave法的SNP解析原理利用Cycleave法的SNP解析原理对照组

17、Control处理组Drug112h重复1重复2重复30h3h6h12h重复1重复2重复33h6h0h-1, 0h-2, 0h-3 (1-3)C-3h-1, C-3h-2, C-3h-3 (4-6)C-6h-1, C-6h-2, C-6h-3 (7-9)C-12h-1, C-12h-2, C-12h-3 (10-12)D-3h-1, D-3h-2, D-3h-3 (13-15)D-6h-1, D-6h-2, D-6h-3 (15-18)D-12h-1, D-12h-2, D-12h-3 (19-21)一一 实验设计实验设计，材料处理，取材冻，材料处理，取材冻存（存（-80-80）标准曲线相对定

18、量法用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因，获得C(t)C(t)值值用内标基因对目标基因均一化用内标基因对目标基因均一化处理样本与未处理样本目标基因处理样本与未处理样本目标基因C(t)C(t)值经内参基因均一化后相除，即值经内参基因均一化后相除，即可得出处理样本与未处理样本的表达差异可得出处理样本与未处理样本的表达差异2-c(t) 法公式推导公式推导 M:M:目标基因，目标基因，N N：内标基因：内标基因 X XC(t)MC(t)M=X=X0M0M* *2 2C(t)MC(t)M=A(=A(域值域值) (1) (1) X XC(t)NC(t)N=X=X0N0N* *2 2C(t)NC(t)N=A(=A(域值域值) (2) (2) 均一化均一化 (1)/(2):(1)/(2): X X0M0M/X/X0N0