草芽孢杆菌的液体发酵及其产物中糖化酶的实验

1、本科学生综合性实验报告学号 姓名 学院 专业、班级 实验课程名称 枯草芽孢杆菌的液体发酵及其产物中糖 化酶的活性测定教师及职称 开课学期 2013 至 2014学年 下 学期 云南师范大学教务处编印一 实验设计方案实验序号实验三实验名称枯草芽孢杆菌的液体发酵及其产物中糖化酶的活性测定实验时间2013.4.7-2013.4.14实验室130（一）实验目的1. 掌握机械搅拌通风发酵罐的基本结构(1) 发酵罐主体(2) 蒸汽灭菌系统：正确把握各阀门的操作(3) 通气系统(4) 加热冷却循环系统：各管道联络关系(5) 搅拌动力系统(6) 智能控制系统2. 掌握发酵罐小试的基本操作，包括：培养基配制，灭

2、菌，接种，参数设定3. 掌握发酵过程中的参数测定和在线控制，包括：pH，DO，温度，搅拌速度，生物量，产物生成量，消泡，CO2。4. 运用所学发酵工程基本理论分析发酵过程中的实验数据，讨论根霉的发酵规律。（二）实验原理及实验流程或装置示意图1、实验原理液体发酵的概念 液体发酵技术是现代生物技术之一，它是指在生化反应器中，模仿自然界将食药用菌在生育过程中所必需的糖类、有机和无机含有氮素的化合物、无机盐等一些微量元素以及其它营养物质溶解在水中作为培养基，灭菌后接入菌种，通入无菌空气并加以搅拌，提供食用菌菌体呼吸代谢所需要的氧气，并控制适宜的外界条件，进行菌丝大量培养繁殖的过程。工业化大规模的发酵培

3、养即为发酵生产，亦称深层培养或沉没培养。工业化发酵生产必需采用发酵罐，而实验室中发酵培养多采用三角瓶。得到的发酵液中含有菌体、被菌体分解及未分解的营养成分、菌体产生的代谢产物。发酵液直接供作药用或供分离提取，也可以作液体菌种。 枯草芽孢杆菌简介1.1生理特性枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞 0.70.8×23微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.60.9×1.01.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨

4、酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。 1.2作用机理1、枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用； 2、枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其它致病菌生长； 3、刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力； 4、枯草芽孢杆菌菌体自身合成-淀

5、粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用； 5、能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性。1.3应用范围 枯草芽孢杆菌不仅在饲料中应该比较广泛,在污水处理及生物肥发酵或发酵床制作中应用也相当广泛,是一种多功能的微生物. 1、 市政和工业污水处理，工业循环水处理，腐化槽、化粪池等处理，畜牧养殖动物废料、臭味处理，粪便处理系统，垃圾、粪坑、粪池等处理。 2、 畜牧、家禽、特种动物及宠物养殖，水产养殖。 3、可以与多种菌种混配，在农业生产中具有重要作用；（如：JT菌种）MBS菌株：在畜禽养殖中使用益生菌不仅可避免长

6、期使用抗生素所引起的肠道微生态平衡被破坏、 产生耐药性及药物残留等问题 ,还能提高动物的生产性能和免疫力。枯草芽孢杆菌能改善肠道微生态环境 ,促进动物生长和提高抗病力 ,而且分泌各种消化酶类 (如蛋白酶、 淀粉酶、 脂肪酶和纤维素酶等 ) ,促进养分的消化、 吸收 ,更重要的是枯草芽孢杆菌在不利环境条件下能形成芽孢 ,在饲料制粒、 贮存及胃酸环境中仍能保持较高活性。因此 ,枯草芽孢杆菌比其他有益微生物有着更多的优点而得到广泛的研究和应用。实验流程：蒸汽管空气灭菌装料通入蒸汽对物料加热排空冷空气冷却、接种通风比和控制参数按要求进行培养。镜检装置示意图：蒸气附属设备下游处理空气附属设备 蒸汽蒸汽蒸

7、汽1 实验设备及材料设备：小型发酵罐的构造 小型发酵罐是实验室进行小规模试验研究的必备装置，如上图所示为小型发酵罐、主要由罐体、通气系统、搅拌系统、加热及控温系统、监测及控制系统等几个部分组成。 1.罐体 罐体是发酵生产微生物菌体或代谢产物的场所，一般由不锈钢、陶瓷或特种玻璃制成，其体积根据需要可从0.1升到100升不等。L1523型发酵罐的体积为19升。由罐盖、罐体和罐底）组成。 （1）罐盖：由耐腐蚀的不锈钢构成，其上有十二个圆孔，分别用于安装pH探头、温度探头、溶解氧探头、气压表、调节pH的补酸、补碱管、排气管过滤器、通气管、放样管和安全阀，靠近外侧的两个孔一般用塞子塞住，主要用于接种、加

8、消泡剂等。 （2）罐体：由耐高温、高压的特种玻璃制成，其内有各种探头、通气管、放样管、搅拌器（图6）和挡板等。 （3）罐底：由具夹层的不锈钢制成，夹层内与加热器和冷却水联通，通过此夹层与发酵罐进行热交换，以控制罐内温度。搅拌器也是通过罐底进入罐体的，称为下搅拌，此外在罐底还有空气分布器，能使压缩空气均匀分布于发酵罐中。 2.通气系统 L1523型发酵罐适用于好气性微生物的发酵生产，其空气来源于空气压缩机。由空压机压缩的高压空气经除油、除水和减压装置减压后，通过预先灭菌的空气过滤器过滤除菌，然后再经空气分布器、搅拌器和挡板等的共同作用，使无菌空气均匀地分布到整个发酵罐。 3.搅拌系统 发酵罐的搅

9、拌装置可分为上搅拌和下搅拌两种类型，L1523型发酵罐属于下搅拌，其搅拌器由搅拌电机驱动，转速高达1000rpm。 4.加热与控温系统 L1523发酵罐为原位灭菌发酵罐，利用自带的小型加热器(锅炉，)，可进行培养基的灭菌和保温，再借助于冷却水(自来水)可使发酵罐内的灭菌温度和发酵温度精确 地保持恒定(误差为±0.1)。 5.监测及控制系统 小型发酵罐一般都配备有监测控制系统，可以监测和控制搅拌器的转速、灭菌和发酵的温度、pH值、溶解氧量等。L1523型发酵罐可通过计算机实现自动控制，中间可 借助蠕动泵和补料系统自动补料和调节pH值等。 材料：培养基、枯草杆菌2 实验方法步骤及注意事项

10、1. 斜面菌种的培养 将已活化两次的试管斜面菌种接种到试管斜面上，30培养1820小时，即为斜面菌种。 2.三角瓶种子的培养 将试管斜面用4.5ml无菌水洗下，然后接种到250ml三角瓶培养基中，每瓶一管，接三瓶，于30，150rpm条件下，振荡培养1820小时（一级种子）。由三角瓶移接入另外500ml三角瓶（或更多的250ml三角瓶）中扩大培养（此为二级种子），保证二级种子接种量7-10%（如13L发酵液则为910-1300ml左右，其中还包括预留一部分作标准曲线用）3.发酵培养基的灭菌 每组配制13L牛肉膏蛋白胨液体培养基（pH7.4），另再加0.1%的酵母膏，用乳胶管小心地加入发酵罐中，

11、然后旋紧塞子，安装好防护罩（见图7），按下面的方法灭菌： （1）检查水、电、气以及发酵罐的密封性是否正常。如正常即可灭菌。 （2）打开进水阀，调节水压使水压表指针指示在0.20.4之间，使水充满加热器，防止烧坏加热器。（出水阀近关闭情况下，达到0.4，此时出水阀虽然关闭，但进水阀打开，此外水压也满足要求，所以水能充满加热器不至于烧坏，当灭菌结束降温时，热水会走另一条旁路（非出水阀的另一条出口）泄压。） （3）打开发酵罐的总电源。（4）打开搅拌器的电源开关，使搅拌器转速控制在300rpm，培养时根据要求调整。 （5）适当开启排气口排气，但应注意：排气口不能开得过大，否则，培养基的水分损失严重！

12、（6）打开温度控制器的电源开关，将灭菌温度设定为121，灭菌时间设定为30min，发酵温度设定为30。启动灭菌开关，进行自动灭菌。 注意：1.灭菌过程中决不能离开人！应随时观察发酵罐有无异常情况，如出现异常应及时请教师处理或关闭总电源。 2.发酵罐的玻璃不能接触冷水！ 3.发酵罐灭菌参数已经设置好，未经教师允许，不得随意改动！ （7）灭菌结束后，发酵罐会自动降温，当温度低于95时，通过无菌操作，安装好已灭菌的空气过滤器，（即关上门窗，解开绳子，放好95%酒精在安装孔的周围，关上进气口，开大出气口，保证极低正压以保安全和防止杂菌落入罐内，先旋松螺盖，点燃95%酒精，在火上操作装上空气过滤器。工具

13、有：尖嘴钳、镊子、95%和75%的酒精）然后，通入无菌空气，使培养基快速降温，并使发酵罐保持一定的正压，以减少污染。 （8）当温度低于35时即可接种发酵。（操作同（7）里类似 ） 4.接种 在发酵罐的罐盖上选择一个塞子，先用75%的酒精棉球在其周围消毒，同时消毒尖嘴钳，然后在塞子周围放置吸满无水酒精的棉花，点燃酒精，用钳子小心打开塞子，取出置于火焰上，将三角瓶种子按5%的接种量迅速倒入发酵罐内，旋紧塞子。 5.发酵 在灭菌达到121时校正溶氧电极的读数为零，接种后当温度达到培养温度、搅拌速度稳定、通气量稳定时，校溶氧电极至95%以上。 搅拌速度设定为350rpm，发酵温度设定为28，开始计时发

14、酵。发酵时间根据细菌生长情况而定，一般约70小时。 发酵过程中，应注意： （1）溶解氧的斜率一般不得低于50%，否则需加大搅拌速度或适当增大通气量。 （2）发酵过程中，应经常观察并记录发酵罐内部的变化情况，如泡沫过多，应及时消泡。消泡方法是采用无菌操作技术，打开发酵罐盖顶的一个塞子，加入消泡剂（豆油），每次用量视具体情况而定（20或30ml），但每批次发酵最多不超过400ml。 （3）发酵过程中应及时记录发酵参数的变化情况。 发酵结束后，应及时的清洗发酵罐和实验用品。 注意：发酵罐体不能用盐酸清洗。 6.绘制枯草杆菌的生长曲线 发酵培养基接种后，从0、1、2、3、4、6、8、10、12、14、

15、16、18、20、24、26、28、30、小时，分别取样测定发酵液的O.D.值，绘制出枯草杆菌的生长曲线。 7.枯草杆菌的镜检 发酵接种以后，12，24，36，每隔12小时芽孢染色镜检一次，观察芽孢和菌体情况确定是否可罐内是否谈判杂菌污染。5 思考题：固态发酵的特点与液体发酵比？ 1、固态发酵培养基中没有游离水的流动，适宜于水活度在0.930.98的微生物生长，限制了应用范围，同时也限制了某些杂菌的生长。 2、营养物浓度存在梯度，发酵不均匀，菌体的生长、对营养物的吸收和代谢产物的分泌存在不均匀。 3、固态发酵中培养基提供的与气体的接触面积大，供氧充足，同时，空气通过固体层得阻力较小，能量消耗低。 4、使用固体原料，在发酵过程中，糖化和发酵过程同时进行，简化操作工序，节约能耗。 5、高底物浓度可以产生高的产物浓度。 6、由于产物浓度高，提取工艺简单可控，没有大量有机废液产生，但提取物含有底物成分。 7、生产机械化程度较低，缺乏在线传感仪器，过程控制较困难二实验报告1实验现象与结果1、镜检 通过碱性染料对枯草杆菌进行染色，观察枯草杆菌的生长状况和检验是否有杂菌污染。取菌液，并固定取片，擦拭干净镜检碱性染料，染色10s后用清水冲洗2对实验现象、实验结果的分析及其结论1、本实验结果经镜检看到的单细胞较少，视野中多为细胞团块，此外，还有明显的细胞碎片。2、由于条件有限，实验室仅有一台倒