芍药苷对胶原诱导型关节炎大鼠外周血单个核细胞糖皮质激素受体的影响

1、描述：研究芍药苷（paeoniflorin，PF）对胶原诱导型关节炎大鼠外周血单个核细胞（PBMCs）糖皮质激素受体（GCR）的影响。采用胶原诱导型关节炎（CIA）大鼠模型，初次免疫后第14天灌胃给予PF .摘要 研究芍药苷（paeoniflorin，PF）对胶原诱导型关节炎大鼠外周血单个核细胞（PBMCs）糖皮质激素受体（GCR）的影响。采用胶原诱导型关节炎（CIA）大鼠模型，初次免疫后第14天灌胃给予PF 25，50，100 mg·kg-1或雷公藤甲素20 g·kg-1或PF 50 mg·kg-1+R

2、U486 15 mg·kg-1， 每天1次，连续给药28 d。末次给药后第2天，除PF+RU486组外所有实验大鼠摘眼球取血，处死并取所有大鼠未免疫关节，ELISA法检测PBMCs中GCR，GCR表 达，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法分析PBMCs中GCR，GCR mRNA表达，免疫组化法分析关节滑膜组织IL-1，NF-B p65，TNF-，PGE2的表达。PF 50，100 mg·kg-1可抑制CIA大鼠关节滑膜组织IL-1，NF-B p65，TNF-，PGE2的表

3、达（P<0.05，P<0.01），而RU486 15 mg·kg-1可明显影响PF 50 mg·kg-1的这一作用（P<0.05）；PF 50，100 mg·kg-1可上调GCR，GCR mRNA的表达、下调GCR和GCR mRNA的表达（P<0.01），PF抑制CIA大鼠关节滑膜炎性介质可能与其调节GCR表达有关。 类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以关节滑膜炎症为主要特征的自身免疫性疾病，糖皮质激素（gluc

4、ocorticoid，GC）具有强大的抗炎调节免疫功 能，是治疗本病的经典药物。芍药苷（paeoniflorin，PF）是白芍总苷的主要药效成分，动物试验显示它能抑制关节炎模型炎性介质的表达。 课题组前期研究发现PF能提高胶原诱导型关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠内源性GC分泌水平。GC主要通过糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GCR）发挥生物学作用，本研究拟进一步观察PF对CIA大鼠外周血单个核细胞GCR及GCR mRNA的影响，同时观察GCR阻滞剂RU486对PF调节C

5、IA关节炎症因子的影响，探讨PF抑制关节炎症因子是否与其调节GCR的表达有关。 1 材料与方法 1.1 试剂和仪器 PF为中国食品药品检定研究院产品，纯度98%；地塞米松（Dexamethasone，DXM）片为广东三才石岐制药有限公司产品；雷公藤甲素 （triptolide，TP）为中国食品药品检定研究院产品，纯度98%；实验时均以5%羧甲纤维素钠配制成所需浓度。牛型胶原（bovine collagen type ，C）和弗氏完全佐剂（complete freunds adjuvan

6、t，CFA）购自美国Sigma公司；淋巴细胞分离液（北京生化试剂公司）；Trizol试剂为Invitrogen公司产品；RNA 提取试剂盒为Biomed公司产品；逆转录聚合酶链式反应试剂盒为TransScript公司产品；GCR，GCR ELISA检测试剂盒为美国R&D公司产品；IL-1，NF-B p65，TNF-，PGE2免疫组化试剂盒为美国Sigma公司产品。Multiskan MK3型酶标仪为Thembo Fisher Labsystems公司产品。 1.2 动物分组和给药 健康Wistar

7、大鼠70只，雄性，清洁级，体重140180 g，由南昌大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（赣）2010-0002。将大鼠随机分为7组，即正常对照组、CIA模型对照组、CIA+PF 25，50，100 mg·kg-1治疗组、CIA+TP 20 g·kg-1治疗组及CIA+RU486（15 mg·kg-1）+PF（50 mg·kg-1）治疗组，每组10只。给药组大鼠于初次免疫后第1442天灌胃给予PF，TP或RU486+PF，模型组和对照组给予相同体积的5%羧甲纤维素钠，每天灌服1

8、次，连续28 d。 1.3 CIA大鼠模型的制备 将2 g·L-1的C（溶解于0.01 mol·L-1醋酸）加入等体积的CFA中，使得C终浓度为1 g·L-1，低温条件下充分乳化。每只造模大鼠右足跖皮内注射100 g C，7 d后在背部和尾根部皮下注射相同剂量的 C加强免疫1次。对照组相同方法注射等体积的生理盐水。 1.4 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell

9、s， PBMCs）的制备 末次给药后第2天，除PF+RU486组外所有实验大鼠摘眼球取血，用淋巴细胞分离液（Ficoll） 分离出PBMCs。 1.5 免疫组化法检测关节滑膜IL-1，NF-B p65，TNF-，PGE2的表达 取血后，将所有实验大鼠处死，每只大鼠取未注射胶原的膝、踝关节并用EDTA脱钙，将脱钙后的关节行冰冻切片，然后用免疫组化法检测关节滑膜IL-1， NF-B p65，TNF-，PGE2。操作按试剂盒说明书进行。然后用图像分析系统进行分析。 1.6 ELISA法检测P

10、BMCs中GCR，GCR的表达 将分离的PBMCs在-20 反复冻融3次，使细胞溶解破裂，然后1 500×g离心10 min，收集上清按ELISA检测试剂盒说明书检测GCR，GCR的表达。 1.7 逆转录PCR法检测GCR，GCR mRNA 将分离的PBMCs混匀，按RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，并用紫外分光光度计检测纯度，A260/A280在 1.71.9，医教论文经琼脂糖电泳分析28S，18S 2条带清晰可见，显示总RNA片段未降解。取总RNA 1 g，加

11、入RI/RT Enzyme Mix 1 L，2×TS Reaction Mix 10 L，oligo dT 1 L，加RNase-freeH2O至终体积20 L建立逆转录（RT）体系，反应条件为42  30 min， 85  5 min，于-20 保存。取逆转录产物2 L，加入2×Hifi PCR SuperMix25 L，特异性引物正义

12、链和反义链各1 L，RNase freeH2O 21 L，使反应终体积为50 L。PCR反应条件为94  30 min；94  30 s，6  1 min，72  1 min，30个循环；最后72 延伸8 min。扩增物以琼脂糖凝胶电泳。基因扩增条带表达量灰度分析的比值计算，作为GCR，GCR mRNA表达的相对水平。引物设计为GCR：Sense CAAAAGAGCAGTGGAAGGAC

13、A，Antisense GAGGTTTCTTGTGAGACTCCTGT；GCR：Sense CCTAAGGACGGTCTGAAGAGC，Antisense CCACGTATCCTAAAAGGGCAC；-actin：Sense AACACCCCAGCCATGTACG，Antisense CGCTCAGGAGGAGCAATGA。 1.8 统计学分析 使用SPSS 16.0统计分析平台，实验数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。P<0.05认为具有统计学差异。 

14、;2 结果 2.1 PF对CIA大鼠关节炎症因子表达的影响 CIA模型组关节NF-B p65，TNF-，IL-1和PGE2明显高于对照组，PF在50，100 mg·kg-1剂量能显著下调上述因子的表达（P<0.05，P<0.01），与TP效果一致；而将PF与GCR阻滞剂RU486合用后明显受到抑制，与 50，100 mg·kg-1剂量组有显著差异（P<0.05，P<0.01），见表1。 表1 PF对CIA大鼠关节NF-B p65，TNF-，I

15、L-1和PGE2表达的影响（±s，n=10） Table 1 Effect of paeoniflorin on immunohistochemical expression of NF-B p65，TNF-，IL-1 and PGE2 protein in synovial tissue of CIA rats（±s，n=10） 注：与对照组相比1）P<0.0

16、5，2）P<0.01；与模型组相比3）P<0.05，4）P<0.01；与RU486+PF组相比5）P<0.05，6）P<0.01；TP组的剂量单位为g·kg-1 （表3，图1，2同）。 2.2 PF对CIA大鼠外周血单个核细胞GCR表达的影响 与正常组相比，CIA模型组大鼠PBMCS中GCR显著升高，GCR和GCR/GCR显著降低（P<0.01）； PF在50，100 mg·kg-1剂量时能显著升高CIA模型大鼠PBMCs中GCR表达及GCR/GCR，降低GCR（P<0.0

17、1），在 25 mg·kg-1剂量时仅GCR有显著性差异，见表2。 表2 PF对CIA大鼠外周血单个核细胞GCR，GCR和GCR/GCR表达的影响（±s，n=10） Table 2 Effect of paeoniflorin on GCR，GCR protein expression and GCR/GCR in PBMCs of CIA rats（±s，n=10）

18、 2.3 PF对 CIA大鼠外周血单个核细胞GCR，GCR mRNA表达的影响 模型大鼠 GCR mRNA显著低于对照组（P<0.01），与模型组比较，PF 50，100 mg·kg-1剂量组显著升高（P<0.01）；模型大鼠 GCR mRNA显著高于对照组（P<0.01），与模型组比较，PF 25，50，100 mg·kg-1剂量组显著升高（P<0.01）；且均与TP组一致，见图1，2。 图1 PF对

19、CIA大鼠外周血单个核细胞GCR mRNA表达的影响（±s，n=10） Fig.1 Effect of paeoniflorin on GCR mRNA gene expression in PBMCs of CIA rats（±s，n=10） 3 讨论 GCR 是一种广泛存在于人和哺乳动物的激素-甲状腺-视黄酸受体超家族蛋白质。它的主要亚型有GCR，GCR，GCR位于细胞浆内，当GC进

20、入胞浆 后， GCR与HSP90，HSP70，HSP40等伴侣分子解离，同时形成GC-GCR二聚体而活化并移位进入细胞核，与核内靶基因中GC反应元件 （glueoeortieoid response element，GRE）结合，控制特定mRNA的产生（如IL-1，IL-6，TNF，IFN-，GM-CSF等）， 图2 PF对CIA大鼠外周血单个核细胞GCR mRNA表达的影响（±s，n=10） Fig.2 Effect of paeoniflorin on GCR mRNA gene expression in PBMCs of CIA rats（±s，n=10） 发挥GC抗炎调节免疫的生物学效应。另外激活的GCR还可通过蛋白-蛋白相互作用的方式对NF-B，AP-1 等促炎转录因子进行转录抑制，产生抗炎效果4。GCR是GCR的