分子生物学实验基础介绍

1、分子生物学的实验方法和技巧分子生物学的实验方法和技巧张照康张照康20162016年年5 5月月31 31日日PCR原理A琼脂糖凝胶电泳B细胞培养技术CLOREM IPSUM DOLORP C R P C R 原理原理P C R P C R 原理原理DNADNA半保留复制半保留复制是DNA在进行复制的时候链间氢键断裂，双链解旋分开，每条链作为模板在其上合成互补链，经过一系列酶（DNA聚合酶、解旋酶、链接酶等）的作用生成两个新的DNA分子。子代DNA分子其中的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种方式称半保留复制。P C R P C R 原理原理聚合酶链式反应（英文全称：聚合酶链式反应（英

2、文全称：Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction），），简称简称PCRPCR。聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。P C R P C R 原理原理PCRPCR技术原理技术原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温

3、时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。P C R P C R 原理原理PCRPCR工作原理工作原理PCR由变性退火(复性）延伸三个基本反应步骤构成：模板模板DNADNA的变性的变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板模板DNADNA与引物的退火与引物的退火( (复性复性) )：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至4060左右，引物与模板DNA单链的互补

4、序列配对结合；引物的延伸引物的延伸：DNA模板与引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。P C R P C R 原理原理P C R P C R 原理原理模板来源模板来源目标生物的细胞，组织，个体等具有活细胞组织中提取。P C R P C R 原理原理设计引物应遵循以下原则：设计引物应遵循以下原则：引物长度：15-

5、30bp，常用为20bp左右； 引物扩增长度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增至10kb的片段； 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 P C R P C

6、 R 原理原理酶，酶，dNTPdNTP（原料）（原料） 公司购买公司购买P C R P C R 原理原理仪器：仪器：P C R P C R 原理原理1、加样P C R P C R 原理原理 2、PCR琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳脂糖凝胶电泳实验原理脂糖凝胶电泳实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳法分离琼脂糖凝胶电

7、泳法分离DNA主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系，因而就可依据DNA分子的大小使其分离，该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳细胞培养技术细胞培养技术细胞培养技术细胞培养技术 细胞复苏细胞复苏主要的实验操作步骤如下： 将完全细胞培养液（500ml DMEM+50ml FBS+5ml 青霉素/链霉素）放入37水浴锅中预热15-30分钟。同时将窗镜台的紫外打开照射； 将以前冻存在液氮管中的细胞取出来，快速的放入37水浴锅中融化，融化期间要不停的轻轻晃动细胞冻存管，加速细胞的融化，融化时间大约为2-3min； 将

8、细胞冻存管用75%的酒精灭菌，然后将细胞冻存管中的细胞转移至另一个装有10ml的离心管中，然后用移液枪一滴一滴的加入细胞培养液，在此过程中不断轻轻晃动10ml离心管，使其混匀； 将10ml离心管封口，然后放入离心机中，室温800g，离心时间3min； 将10ml离心管用75%的酒精灭菌，然后放入窗镜台中，用吸液器将细胞培液吸掉，在用新鲜培液将细胞沉淀轻轻吹打均匀，转移至6cm细胞板中，前后左右轻轻晃动几下； 将复苏好的细胞放入细胞培养箱中培养，6-8小时后换一次培养液（6h后细胞基本上贴壁），然后继续培养。注：每一个拿进窗镜台的东西都要用75%的酒精擦拭一遍，防止污染细胞培养技术细胞培养技术细

9、胞传代细胞传代一般是当细胞的贴壁密度为70-90%左右的时候进行传代。主要的实验操作步骤如下：将完全细胞培养液（500ml DMEM+50ml FBS+5ml 青霉素/链霉素）、0.25%胰酶以及1xPBS放入37水浴锅中预热15-30分钟。同时将窗镜台的紫外打开照射；用75%酒精擦拭手套、窗镜台台面、细胞培养液瓶、胰酶瓶以及1xPBS瓶；将细胞培养皿从细胞培养箱中取出来，放入窗镜台中，用吸液器将细胞培养液吸掉，加入适量的1xPBS，轻轻晃动细胞培养皿；用吸液器将1xPBS吸掉，然后加入适量的0.25%胰酶，然后放入37培养箱消化1-5min，根据细胞贴壁性能确定时间；细胞从壁上消化下来后，用

10、移液枪轻轻吹打细胞，使其消化成为单个细胞，然后加入等量的细胞培养液，终止细胞消化；将细胞培养皿中的细胞转移到15ml的离心管中，然后将15ml离心管转移至离心机中，室温800g，离心3min；将15ml离心管用75%的酒精灭菌，然后放入窗镜台中，用吸液器将细胞培液吸掉，在用新鲜培液将细胞沉淀轻轻吹打均匀，转移适量比例的细胞至几个10cm细胞板中，前后左右轻轻晃动几下，使其均匀铺板；将已经传代好的细胞放入CO2细胞培养箱当中培养。细胞培养技术细胞培养技术细胞冻存细胞冻存首先配置新鲜的冻存液：90%的完全培养基（DMEM+10%FBS（FBS可以适量的增加至20%）+5%青霉素与链霉素）+10%D

11、MSO（DMSO需要过滤除菌）；冻存步骤和传代步骤类似，用75%酒精擦拭手套、窗镜台台面、细胞培养液瓶、胰酶瓶以及1xPBS瓶；将细胞培养皿从细胞培养箱中取出来，放入窗镜台中，用吸液器将细胞培养液吸掉，加入适量的1xPBS，轻轻晃动细胞培养皿；用吸液器将1xPBS吸掉，然后加入适量的0.25%胰酶，然后放入37培养箱消化1-5min，根据细胞贴壁性能确定时间；细胞从壁上消化下来后，用移液枪轻轻吹打细胞，使其消化成为单个细胞，然后加入等量的细胞培养液，终止细胞消化；将细胞培养皿中的细胞转移到15ml的离心管中，然后将15ml离心管转移至离心机中，室温800g，离心3min；将15ml离心管用75%的