乙肝病毒生活史侵入肝细胞与病毒组装

1、乙肝病毒生活史：侵入肝细胞与病毒组装HBV Life Cycle: Entry and Morphogenesis摘要：乙型肝炎病毒（HBV）是导致肝病的主要原因。乙型肝炎病毒主要以一种尚未明确的机制感染肝细胞。在经历吞饮过程之后，核衣壳释放进入细胞质，开环DNA（rcDNA）基因组向细胞核转运，并在其中转变为共价闭合环状DNA（cccDNA）。病毒基因组通过与HBV多聚酶结合的前基因组RNA进行复制。多聚酶触发衣壳内前基因组的壳体化和内转录。包含有开环DNA的成熟核衣壳能够将开环DNA再次输运至细胞核，或者通过与包膜蛋白的相互作用得以分泌成为子代病毒颗粒。关键词：乙型肝炎病毒；侵入；形态发生

2、病毒组装；肝病1. 前言人类乙型肝炎病毒属于嗜肝DNA病毒科。嗜肝DNA病毒科分为2个种属：哺乳动物病毒属和禽病毒属。前者包含人类乙型肝炎病毒（HBV，以下简称乙肝病毒），旱獭肝炎病毒（WHV）以及地松鼠乙型肝炎病毒（GSHV）。鸭乙型肝炎病毒（DHBV）和苍鹭乙型肝炎病毒（HHBV）属于禽病毒属1。嗜肝DNA病毒科具有以下共同特点：¨ 由一段完整的编码链（负链）和一段不完整的非编码链（正链）构成的部分双链基因组DNA；¨ RNA依赖性DNA多聚酶；¨ 通过前基因组RNA模板进行复制；¨ 高度的种属和组织特异性； 乙肝病毒的部分双链DNA基因组长度约为3

3、.2kb。病毒基因组使用全部三种读码框，并包含至少四种不同的开放阅读框，分别编码病毒多聚酶、核心抗原（HBcAg）、e抗原（HBeAg）、HBX调节蛋白以及对三种表面抗原（包括乙肝病毒表面大蛋白LHBs、表面中蛋白MHBs、表面小蛋白SHBs）进行编码的前S基因/S基因（图1）。乙肝表面抗原大蛋白图1. 乙肝病毒颗粒和亚病毒颗粒的结构示意图。乙肝病毒是一种包膜病毒，直径约为42nm（42n颗粒）。包膜由包裹病毒核衣壳的三种表面蛋白（乙肝病毒表面大蛋白、乙肝病毒表面中蛋白、乙肝病毒表面小蛋白）形成。核心抗原形成核衣壳，核衣壳中包含与病毒多聚酶共价连接的部分双链环形DNA基因组。在乙肝病毒阳性病人

4、的血清中可发现大量无传染性的丝状(管状)或球状亚病毒颗粒（20nm颗粒），这些病毒颗粒由病毒表面蛋白构成，但缺乏病毒核酸。感染乙肝病毒可引起急性或慢性肝炎。乙肝病毒也是导致肝细胞癌（HCC）的主要病原体2，3。鉴于上述原因，许多研究关注于潜在的病毒致癌物的鉴定。除此之外，有关病毒生命周期的许多方面的问题仍未明确。本文对病毒生命周期进行了概述，着重介绍了新合成病毒颗粒的粘附、侵入以及病毒组装。2. 乙肝病毒的结构蛋白2.1 包膜蛋白乙肝病毒表面蛋白由一个开放阅读框进行编码，此阅读框被三个框内AUG起始密码子分为下列区域：前S1区、前S2区和S区。乙肝病毒大蛋白包括前S1区（108或109个氨基酸

5、，依赖于基因型不同而有所不同）、前S2区（55个氨基酸）和S区（226个氨基酸）；表面中蛋白包括前S2区和S区；表面小蛋白由S区构成4。所有三种表面蛋白均具有的S区在第146位的天门冬酰胺处存在一个N-糖基化位点。所有三种表面蛋白均部分使用此位点1,5,6。在前S2区的第4位天门冬酰胺处也存在一个糖基化位点，仅表面中蛋白使用此位点（图2）。此外，有证据表明，C、D基因型乙肝病毒的表面中蛋白和表面大蛋白，其前S2区在第37位的苏氨酸处均发生了部分O-糖基化，其中表面大蛋白程度较轻。A基因型乙肝病毒不包含第37位或第38位的苏氨酸，因而无O-糖基化发生7。乙肝病毒包膜蛋白属于膜内在蛋白，其S区锚定

6、于膜内8，9。N末端信号序列（第8位至第22位氨基酸）启动了S蛋白的膜嵌入，此序列并未发生剪切而是形成了首个跨膜区（TM1）。在成熟的蛋白质中，第23位至第79位氨基酸面向细胞质。在第80位至第98位氨基酸处，形成第二个跨膜区（TM2）的第二信号引导着生长链经内质网膜（ER）易位进入内质网膜腔，直至位于第170位氨基酸处的S区域疏水性C末端位点（位于内质网膜内）启动。C末端区域（为第170位至第226位氨基酸）的具体结构还不是十分明确，一般将其看作一个或两个跨膜区（TM3/TM4）9，10。在完整的S蛋白中，N末端（第1位至第7位氨基酸）以及处于第99位至第169位氨基酸之间的回路（loop环

7、）面向内质网管腔，而第23位至第79位氨基酸之间的区域则面向细胞质。由于位于第99位至第169位氨基酸之间的回路（loop环）定位于内质网管腔中，这就使得内质网管腔中的N-糖基转移酶对第146位天冬门酰胺位点进行N-糖基化成为可能。除此之外，这个回路（loop环）包含乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的主要构象表位。在成熟病毒颗粒出芽之后，这些管状区域暴露于病毒颗粒的外表面上11-13。就乙肝病毒表面中蛋白而言，它与乙肝病毒表面小蛋白在S区域的拓扑结构方面没有差异。表面中蛋白的N末端前S2区域（PreS2）翻译后移位进入内质网管腔，从而使得第四位天冬门酰胺位点可接触到N-糖基转移酶（图2）。因此，

8、表面中蛋白以三种形式存在：非糖基化（p30）、单糖基化（gp33）和双糖基化（gp36）5, 11。乙肝病毒大蛋白采取了一种奇特的生物合成方式。由于S区的跨膜区（TM1）没有被用作翻译信号序列，因此它的亲水性preS区（PreS1-PreS2）没有发生翻译移位。结果，preS区和S区的一部分（即上游区域的79个氨基酸），均保留在内质网的细胞溶质表面。跨膜区（TM2）将增长中的表面大蛋白锚定于内质网膜，从而使得下游序列移位进入内质网管腔，最终造成了仍面向内质网管腔的S区第146位天门冬酰胺的糖基化14-16。由于这种拓扑结构，与表面中蛋白相反，表面大蛋白前S2区第4位的天门冬酰胺不能发生N-糖基

9、化14, 17。位于表面大蛋白前S1区的第二个位点的甘氨酸残基发生豆蔻酰基化作用18，19。这里有一个有趣的现象，大约50%的大蛋白发生了翻译后易位20，并最终形成了成熟表面大蛋白的双重拓扑结构。这种翻译后易位的结果就是“未使用过的”跨膜区（TM1）整合入内质网膜，而使得前S1-前S2区面向内质网管腔。在表面蛋白的二元拓扑结构之间好像存在着一种平衡，最近的报道提示翻译后拓扑结构再定位的控制与侣伴蛋白有关21-23。就病毒生命周期而言，表面大蛋白的不同拓扑结构形式具有不同的功能。在成熟的分泌病毒颗粒中，最初面向内质网管腔的preS区暴露于病毒颗粒的外表面，并且对于病毒-细胞的相互作用很重要（图1

10、）。另一部分preS区面向细胞质的表面大蛋白通过与核衣壳的相互作用在病毒的病毒组装中发挥着至关重要的作用24。乙肝病毒表面大蛋白图2. 乙肝病毒表面蛋白结构示意图。三种乙肝病毒表面蛋白均存在S区。就乙肝病毒表面大蛋白而言，跨膜区（TM1）不作为起始穿膜信号，导致大蛋白preS区面向细胞质。在一小部分表面大蛋白中，大蛋白preS区发生了翻译后易位，穿过了内质网膜。在这种情况下，大蛋白preS区面向内质网管腔。两种形式的表面大蛋白实现了不同的功能。preS区面向内质网管腔的这部分表面大蛋白暴露于成熟病毒颗粒的病毒表面，与吸附过程有关。其preS区面向细胞质的另一部分表面大蛋白调节与核衣壳的接触，并

11、且通过前S2区与蛋白激酶C（PKC）的相互作用启动细胞间信号转导级联反应。除了这些病毒组装功能之外，大蛋白前S2区的细胞质定向能力与其作为调节蛋白的额外功能有联系。面向细胞质的前S2区存在于表面大蛋白和C末端截断的表面中蛋白中2, 17, 25-27，后者由3末端截断前S/S序列（pres/S）进行编码，此序列是从与乙肝病毒有关的肝癌中分离获得的。在这种构象中，大蛋白的前S2区结合并激活蛋白激酶C。依赖于前S2区的蛋白激酶C的激活导致c-Raf/MEK信号级联放大通路的激活，而后者控制许多种细胞和病毒启动子的表达28。依赖于大蛋白前S2区的激活和依赖于HBx调节蛋白的激活具有许多共同的特点2，

12、29。有证据显示依赖于HBx调节蛋白或大蛋白前S2区的激活对于乙肝病毒的复制至关重要。关于乙肝病毒的表达，大蛋白前S2或HBx的选择性基因剔除可由其它未受影响的乙肝病毒调节蛋白进行补偿29, 30。然而，同时发生的大蛋白前S2和HBx的基因剔除中止了乙肝病毒的复制29。乙肝病毒表面蛋白不仅仅是病毒颗粒的一部分。它们来源于内质网后/高尔基体前的膜31，未经核衣壳的包裹，进入囊状结构的管腔，最后以分泌方式得以释放。这些亚病毒颗粒直径为20nm，呈八面体对称结构32。此外，亚病毒颗粒还可形成长度不等的丝（管）状结构（图1）。与病毒颗粒相比较，亚病毒颗粒过度增殖。在感染乙肝病毒的病人血清中，可发现亚病

13、毒颗粒与病毒颗粒之比超过10000。亚病毒颗粒与病毒生命周期的关联性还不清楚。这些颗粒可能干扰宿主的免疫系统或者促进感染过程33。详细分析显示乙肝病毒亚病毒颗粒是通过S蛋白的自我装配形成内质网管腔内的分枝丝状体而生成的。接下来，这些长的丝状体折叠交联打包形成晶体状结构，然后由内质网衍生的小囊泡运送至内质网-高尔基中间腔（ERGIC）。在内质网-高尔基中间腔中，这些丝状体得以拆解和释放。由于它们的尺寸问题，通过分泌通路的进一步运输或许会受到限制。因此，这些丝状体需要转换成为球形颗粒。小的分枝丝状体可由内质网管腔中的乙肝病毒大蛋白生成，但这些丝状体没有打包进入运输小囊泡，这可以解释细胞内大蛋白驻留

14、的现象34。2.2 核衣壳乙肝病毒核衣壳由核心抗原构成，而核心抗原在不同基因型之间相对保守35。核心抗原根据基因型不同包含183个或185个氨基酸，核心抗原的基本序列可分为两部分：1）N末端的149个或151个氨基酸（取决于基因型的不同）足够完成衣壳的自我装配，这部分称为装配区域；2）C末端的34个氨基酸被标定为鱼精蛋白区，其富含精氨酸残基，而这些残基使此区域带一个单位的正电荷，这一区域对于前基因组/乙肝病毒-多聚酶复合物的包装至关重要36, 37。核心抗原可在原核与真核表达系统中过度增值，并在这些系统中装配成为衣壳颗粒38。衣壳装配的起始伴随着核心抗原二聚体的形成，二聚体之间通过第61位的半

15、胱氨酸之间的二硫键连接39-41。衣壳的装配可不依赖于细胞因子在体外进行42, 43。控制纯化后的核心抗原二聚体装配的关键因素是核心抗原二聚体的浓度和缓冲液的成分42。在病毒生命周期过程中，多聚酶与病毒前基因组的结合起始了衣壳的形成，但这一过程受控于一些细胞因子，如：侣伴蛋白和激酶44-49。除此之外，有些报道描述了蛋白激酶C结合进入乙肝病毒衣壳中的现象50。最近的一篇报道揭示了装配区域中第106位丝氨酸的蛋白激酶C依赖性磷酸化与装配核增多之间的联系。此外，尽管衣壳中螺旋含量的比例有所降低，但发生在第106位丝氨酸处的磷酸化作用不仅促进了衣壳装配，似乎也提高了装配核的稳定性51。这些因素或许可

16、降低衣壳生成所需的阈值浓度。原则上，核心抗原二聚体可装配成为两种不同类型的颗粒：一方面，直径为30nm的颗粒由90个核心抗原二聚体构成，呈现出T=3对称性；另一方面，直径为34nm的较大颗粒由120个二聚体装配，呈现出T=4对称性52。尽管两种形式的颗粒在核心抗原生成系统中均存在，但在传染性的病毒颗粒中主要是T=4衣壳，T=3衣壳仅存在于10%的病毒颗粒中12。根据冷冻电子显微镜技术53, 54和衣壳的结晶化分析43, 55，可以详细剖析衣壳的结构。衣壳最显著的特点就是两侧有小孔分布的表面刺突。每一刺突可分布于两种不同的环境中，这两个环境既可以是两个六边形的一部分，也可以是一个六边形和一个五边

17、形的一部分。刺突由核心二聚体构成。来自每一个亚单位的两个逆平行螺旋，由第78位至第83位氨基酸之间的短回路连接，联合成为四螺旋束43, 53-55。连接螺旋的环形成了刺突尖端，代表着衣壳抗原主要表位。装配的衣壳既不是一个致密外壳，也不是一个坚硬不可弯曲的颗粒。RNA前基因组转化为DNA基因组需要将核衣壳输送进入衣壳腔。衣壳外壳上分布有小孔，直径位于12埃-15埃（2 Å - 15 Å）之间。这些小孔可以使小分子自由扩散进出衣壳腔56-58。外部序列可嵌入位于第78位至第81位氨基酸之间的刺突尖端，而且不会影响形成衣壳的能力59-60。上述观察现象表明衣壳结构既具有高度的稳定

18、性，又具有极佳的柔韧性56, 61。来自外部的对构象变化的诱导，伴随着内部衣壳组织结构的变化56。衣壳腔与表面之间的这种构象联系，或许与在RNA前基因组转化为成熟DNA基因组的过程中对衣壳成熟的控制有关57, 58, 62。影响核衣壳的形成可能是控制乙肝病毒感染的一种替代性治疗方法。最近发现异芳基二氢嘧啶（heteraryldihydropyrimidine, HAP）Bay 41-4109以一种针对核心抗原的方式发挥作用，因此可抑制病毒复制63。一份更详细的分析显示Bay 41-4109可加速并错误指导衣壳装配64。依据Bay 41-4109与二聚体的比例不同，Bay 41-4109可发挥稳

19、定效应（Bay 41-4109与二聚体的比值达到1：2），也可发挥破坏稳定作用，生成大的非衣壳HBcAg凝聚物（Bay41-4109与二聚体之比达1：1或更大）64-66。从这些数据可以得到以下结论：浓度较低时，Bay41-4109通过诱导不恰当的衣壳装配影响病毒复制，而在浓度较高时，通过错误指导从衣壳形成到大HBcAg凝聚物形成过程中的装配影响病毒复制。3. 感染过程3.1 粘附根据病毒感染的一般概念，第一步是病毒颗粒以能量非依赖型的方式粘附到宿主细胞表面的某一结构上。首次粘附的特点是亲合性和可逆性较低。首次粘附之后，病毒颗粒转移到一个更特殊的受体。就有包膜病毒而言，与受体结合之后通常是融合

20、步骤，可发生在细胞膜，也可发生在内涵体间隔67。目前，乙肝病毒生命周期中最初步骤的许多方面仍不为人所知。然而，近年来，基于不同体外感染系统的建立，在这方面已取得了显著进展。3.2 实验系统人类原代肝细胞（PHH）是研究乙肝病毒感染的经典体外感染系统68, 69。这些细胞的主要缺陷在于不易获得且不同供体之间差异较大。除此之外，感染效率较低导致获得的感染细胞极少70，71。树鼩（Tupaia belangeri）原代肝细胞（PTH）是另一种可供选择的细胞培养系统72。树鼩原代肝细胞更易获得且不同制备品之间的差异较小。树鼩原代肝细胞的可感染性与人类原代肝细胞相当。然而，与人类原代肝细胞不同的是，树鼩

21、原代肝细胞除能被人类乙肝病毒感染外，还可被羊毛猴乙肝病毒感染73，74。使用树鼩原代肝细胞作为感染模型，不足之处在于这种细胞培养系统缺乏特征性，许多鼠类或人类靶标特异性的抗血清与相应树鼩蛋白之间的交叉反应情况目前尚不明确。基于这个原因，还是希望获得能够感染乙肝病毒的人类肝细胞系。就人类肝细胞系HepG2而言，尽管已有许多报道描述了乙肝病毒的特异性结合和提呈75-78。然而，仅有两篇文献报道了成功的HepG2感染，且在实验中均在细胞的培养体系中加入了二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide, DMSO，译者注一种有机液体试剂，可增加细胞膜的通透性。）和脱氧氮胞苷（5-aza-2deox

22、ycytidine，译者注一种抗肿瘤药）76，79。有报道称，从一例女性丙肝阳性的肝癌患者身上提取并建立了的一种新型肝细胞系HepaRG，这种细胞系经二甲基亚砜和皮质醇（hydrocortisone，译者注副肾荷尔蒙中的一种；）分化后易感染乙肝病毒80，并使乙肝病毒感染的稳定重现成为可能。在活动性感染（译者注productive infection，也称产毒型感染，是指病毒可在宿主体内完成复制，并扩散；与其对应的是潜伏型感染latent infection或非产毒性感染，是指病毒进入宿主细胞后，没有子代病毒产生，也不引起宿主细胞病变，但受感染的细胞内有病毒 DNA存在。）分析中面临的一个普遍问

23、题是区分输入与重新合成的病毒或亚病毒颗粒。乙肝病毒活动性感染的一个明确标志物是共价闭合环状DNA（cccDNA）的形成（参见最近的一篇综述文献81）。共价闭合环状DNA可通过DNA印迹法（译者注Southern blotting索瑟恩印迹：由E.M. Southern发明并以其名字命名的用于检测DNA混合片段中特殊顺序的技术，亦称为DNA印迹法；）或实时PCR方法进行检测，其中实时PCR仅对共价闭合环状DNA进行选择性扩增，而对其它病毒DNA则不进行扩增82。在感染的树鼩原代肝细胞和人类原代肝细胞中可检测到共价闭合环状DNA，而对于HepaRG细胞而言却似乎检测不到共价闭合环状DNA83。病毒

24、mRNA检测方法的出现为区分是输入还是重新合成的病毒提供了新的选择。由于经历浓缩过程之后病毒接种物中已经不存在HBeAg了，因而接种浓缩或纯化的病毒时，乙肝病毒e抗原是酶联免疫吸附法检测的一种很好的靶标。乙肝病毒表面抗原的检测灵敏度高于e抗原，但必需进行反复的细胞清洗84。3.3 病毒-细胞相互作用一般认为乙肝病毒感染是一个多级的过程。尽管对鸭乙肝病毒系统而言，肝素或硫酸葡聚糖对感染过程没有影响85，但对乙肝病毒来说，有报道称乙肝病毒感染中最初的粘附过程与粘附受体之间存在相关性，此受体正是与肝细胞相关的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulphate proteoglycan）的碳水化合

25、物侧链86，87。这种相互作用启动了乙肝病毒的多级侵入过程，随后是介导乙肝病毒提呈的的高亲合性步骤，但其具体机理还不为人知。“乙肝病毒受体”或乙肝病毒结合配体的鉴定是乙肝病毒生物学领域中一个极具挑战性的开放性问题。可与乙肝病毒结合的蛋白数量越来越多，但没有令人信服的证据表明这些潜在的结合因子在感染过程中发挥至关重要的作用（参见文献88）。尽管人们对于介导病毒结合和侵入的细胞结构了解不多，但对于与结合和侵入有关的病毒结构了解较多。有关病毒与肝细胞结合先决条件的描述中具有里程碑意义的是1986年Neurath等人的观察结果75。Neurath及其同事报道的观察结果如下：一个短的包含前S1区第21位

26、至第47位氨基酸（对应于基因型D，E，G的第10位至第36位氨基酸）的表面蛋白片段与HepG2细胞结合，并最终完成乙肝病毒与这些细胞的结合。与此研究结果相一致的是，已发现乙肝病毒前S1区第3位至第77位氨基酸对于病毒的感染性至关重要89。Paran等人鉴定了一种QLDAPF基序（对应于第18位至第25位氨基酸），此基序是乙肝病毒结合的重要区域76。乙肝病毒感染的又一个结构性先决条件是发生在前S1区第二位甘氨酸上的豆蔻酰基化18，19。已观察到一个豆蔻酰基化的前S1区肽段较之无豆蔻酰基化的前S1区，对以HepG2细胞构成的细胞膜具有更强的结合性90。详细的研究表明，包含前S1区N末端部分的酰化肽

27、段可有效地抑制了乙肝病毒和丁肝病毒的感染91-94。一个重要参数是N末端酰基残基的疏水性。抑制能力的提高与脂肪酸链长的增加有关。戊基（C5）不如癸基（C10）有效，而癸基又不如豆蔻酰基-十四酰基（C14）有效。就肽段序列而言，第1位至第8位残基与第19位至第28位残基对于抑制作用并不重要；但是，第9位至第18位氨基酸残基却发挥着至关重要的作用。与此相对应，在前S1区第9位至第18位氨基酸之间发生突变的重组体乙肝病毒不具有传染性91。这些肽段发挥抑制作用的机制目前尚不明了。8nM为极低的半抑制浓度（IC50），但即使是这种低浓度的肽段，而且是在病毒粘附已经发生后再加入，仍然发挥了有效的抑制作用。

28、这完全不同于简单的竞争性抑制作用。除此之外，在肽段结合的特异性以及各个细胞对乙肝病毒感染的易感性之间不存在明显的相关性。在尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂（uPA）免疫缺陷型小鼠身上注入人类原代肝细胞和树鼩原代肝细胞后，分析这些肽段的生物分布。结果显示，大蛋白乙酰化肽段在肝脏中发生积累，但并未优先结合输入的人类原代肝细胞或树鼩原代肝细胞 95。由此可以推断，这些大蛋白的肽段通过干扰调节乙肝病毒感染的信号转导级联或早期阶段的侵入后步骤抑制病毒感染。尽管前S1区包含主要的细胞粘附抗原表位，但有报道称在前S1区外也有抗原表位，它们也参与乙肝病毒-细胞粘附过程。Paran等人描述了在S区存在次级粘附位点7

29、6。此外，识别前S2区或S区内抗原表位的抗体对感染具有抑制作用96。但是，这些抗体是通过直接遮盖乙肝病毒-细胞粘附的重要序列发挥作用，还是它们的结合可发挥间隔物作用，从而阻碍病毒和细胞表面之间的紧密接触，目前还不清楚。另外，可能存在对侵入后步骤的干扰。来自鸭乙肝病毒系统的数据显示，嗜肝DNA病毒科病毒的吞入由细胞内吞过程实现97-99。并观察到鸭乙肝病毒颗粒与荧光标记的转铁蛋白一起进入了内涵体间隔100。此外，有证据显示，抑制空泡质子三磷酸腺苷酶的巴弗洛霉素A1（译者注bafilomycin A1属于大环内酯类抗生素，具有抗革兰阳性细菌和真菌的活性；有免疫抑制活性，并且是空泡质子三磷酸腺苷酶的

30、第一个有效的特异性抑制剂。）对感染有消弱作用。3.4侵入与将核衣壳释放入细胞质乙肝病毒的活动性感染需要将基因组输送至细胞核81。由此而引发的问题涉及病毒/核衣壳侵入细胞以及随后的基因组向细胞核内的输送。与表面包含I型融合蛋白的病毒不同，乙肝病毒不具备经典的融合肽序列67, 101, 102。最近的一篇报道把融合因子的功能归因于乙肝病毒的前S1区103。在序列分析基础之上，Rodriguez-Crespo等人认为，S区（第1位至第23位氨基酸）的N末端，包括跨膜区1（TM1），或许发挥融合因子序列的作用104。这种假说得到下述观察现象的支持，具有S区序列第7位氨基酸至第18位氨基酸的流感病毒嵌合

31、体融合蛋白（血凝素），显示了明显的半融合活性101。此外，经低pH处理的鸭乙肝病毒亚病毒颗粒在表面暴露出疏水区域，而这一疏水区域可以介导细胞膜接触105。进一步的分析显示鸭乙肝病毒大蛋白（而非S蛋白）中跨膜区1疏水性的降低导致感染性的消失。此外，对应于跨膜区1的合成肽的体外实验表明，磷脂小囊泡的积聚和脂质混合离不开跨膜区1的疏水特性100, 105。尽管这些数据显示跨膜区1可发挥融合因子序列的作用，但迄今为止，没有直接的实验证据表明乙肝病毒侵入过程中跨膜区1与宿主细胞膜发生融合。对于ayw基因型的乙肝病毒而言，其前S2区在第41位与第52位氨基酸之间包含一个膜透过性肽段，这个肽段被称为易位基序

32、（TLM）。易位基序在所有嗜肝DNA病毒科中保守存在106。易位基序属于膜透过性肽家族。易位基序与其它肽段或蛋白的融合使得穿经细胞膜进入细胞质的易位得以实现，而且此易位过程与能量和受体无关30, 106-109。易位基序作为一种膜透过性肽段，其功能取决于亲水性与疏水性氨基酸的特定构成模式，不同的构成模式使得易位基序可形成性质异变的兼性螺旋17，106。（译者注相同序列的肽段，构象不同时可表现为完全不同的亲水性或疏水性，这与亲水性或疏水性氨基酸的暴露有关。）易位基序与乙肝病毒核心抗原的融合表明，装配完全且在表面得到易位基序-肽段修饰的核衣壳能够穿过细胞膜并把包装好的核酸输送至细胞核108。这些数

33、据显示，即使其他种类的颗粒只要其表面具有易位基序肽段，便也可穿过细胞膜。在此基础之上，可进一步分析易位基序肽段是否在应用鸭乙肝病毒系统的乙肝病毒侵入过程中也发挥作用。与乙肝病毒不同，鸭乙肝病毒在preS区包含两个易位基序。感染实验表明，只要其中一个易位基序被破坏，病毒的感染性便会消失99。更详细的分析显示，易位基序缺陷型鸭乙肝病毒颗粒仍然能与细胞结合，并能够进入细胞内吞路径，但最终易位基序缺陷型突变体只能在内涵体间隔中积聚（而无法进入细胞核）。进一步的实验研究显示，在内涵体间隔中发生了针对内吞病毒颗粒的蛋白水解过程，并最终导致易位基序肽段的暴露。可以得出以下结论，由于胞内蛋白水解过程，裸露的易

34、位基序使得穿经胞内膜进入细胞质成为可能。在细胞质中，经蛋白水解过程处理的被膜从核衣壳中分离出来。通过与胞内溶菌产物预孵育，已经被蛋白水解处理过的乙肝病毒与鸭乙肝病毒颗粒，显示出了穿过细胞膜进行易位的能力。将HepG2细胞与经蛋白水解处理的乙肝病毒或LMH同孵育，可使HepG2细胞发生活动性感染，而未经处理的病毒无法感染这些细胞99。根据这些数据可以推论，嗜肝DNA病毒科不是通过融合过程运送核衣壳进入细胞质，而是依赖于一种全新的建立在膜易位基础上的机制99。但是，已有文献对此模型提出异议，认为：丁肝病毒的侵入就不依赖与易位基序的作用110，111，而乙肝病毒中易位基序的突变或缺失似乎不影响它的感

35、染性110, 112。然而，最近的数据对丁肝病毒是否是研究乙肝病毒侵入的合适模型系统提出了疑问。尽管包含旱獭包膜蛋白的嵌合体颗粒不能感染人类原代肝细胞，但由旱獭肝炎病毒包膜蛋白装配的重组体丁肝病毒可感染人类原代肝细胞，这表明丁肝病毒和乙肝病毒的侵入过程之间存在显著差异113。对易位基序突变的乙肝病毒进行的详细分析112显示，由于易位基序C末端或N末端部分的局部缺失，一种新功能的易位基序得以生成。然而，这种点突变将易位基序的结构转换为稳定的折叠片，由此造成的对易位基序的破坏导致对人类原代肝细胞的感染性完全消失（E.Hildt未发的表研究结果）。3.5 基因组输入细胞核成熟核衣壳114的脂转染或膜

36、渗透性核衣壳对人类原代肝细胞以及肝癌细胞的转染108显示，核衣壳通过定向转运朝细胞核移动。这一点可由细胞内运输动力学推断获得115。核衣壳进入细胞质之后的核周积聚可在15分钟内观察到，而一个基于扩散的过程将耗时超过1小时116。在核衣壳的细胞内转运中发挥主要作用的是微管系统114。关于肌动蛋白丝与核衣壳胞内转运相关性的问题，以引发了一些的争论 108, 117。有效病毒感染需要将乙肝病毒基因组输送进细胞核，并在其中转换为共价闭合环状DNA（参见文献81）。对于病毒基因组输入细胞核是否与乙肝病毒核心抗原之间存在关联尚存在疑问。由于可获得的感染系统的感染效率有限，且最终释放进入细胞质的核衣壳数量较

37、少，因而对此问题进行探讨较为困难。研究此问题的一个方法是借助经洋地黄皂苷透化处理的细胞，将透化处理后的细胞立即与核衣壳混合118。基于这种实验系统，可观察到核心颗粒与核膜孔复合体的磷酸化依赖型结合 119。作者在先前的研究中观察到，蛋白激酶C通过壳体化作用可进入核心颗粒50，因此作者假定壳体化的蛋白激酶C可使核心蛋白中C末端丝氨酸残基发生磷酸化，并产生成熟的磷酸化的子代核心颗粒。但是，这种假设似乎与最近的观察到得现象相反，最近研究发现乙肝病毒衣壳成熟与分步脱磷酸化作用有关联58, 62。这个课题组的深入研究发现，不成熟的衣壳到达核膜孔复合体的篮状细胞，但并不释放衣壳蛋白或不成熟基因组进入核原生

38、质。就成熟衣壳而言，可观察到乙肝病毒核心抗原的核内染色120。然而，洋地黄皂苷透化过程影响了细胞的完整性。透化作用杀死了细胞并造成细胞蛋白的丢失。痕量的洋地黄皂苷或许会影响核衣壳的稳定性。此外，经筛选的抗血清（Dako HBcAg，译者注该抗血清是使用丹麦Dako公司的乙肝病毒核心抗原制备而成的。）可检测到核心抗原二聚体和完全装配的颗粒。因此，无法承认装配颗粒已易位进入细胞核的结论。显微注射核衣壳进入非洲爪蛙卵母细胞后的电子显微镜数据显示，在此系统中，衣壳通过核膜孔进入核篮状细胞。但是，已发现即便是不成熟的核衣壳也可进入核篮状细胞121。因此推测仅能发生成熟核衣壳的解聚，并最终导致与多聚酶连接

39、的病毒基因组释放进入核篮状细胞。 最近的一篇报道描述了一种可将基因转入肝细胞的有效系统，该系统是基于细胞透过型核衣壳108。易位基序肽段106与乙肝病毒核心抗原的融合使得核衣壳具有了细胞渗透性。易位基序肽段-乙肝病毒核心抗原二聚体装配成为二十面体结构的衣壳。这一肽段可以使一些物质（与易位基序融合的蛋白或或肽段）的受体非依赖型易位得以穿过细胞膜，同时又不影响细胞的完整性30,107,122。这些易位基序-核衣壳作为完全装配的颗粒穿过细胞膜，且不影响细胞完整性。最终，乙肝病毒基因组或其包装后进入易位基序-核衣壳的衍生物得到有效表达，这表明发生了有效的输送，并以包装基因组的表达为终点108。采用这种

40、系统与一种可选择性识别完全装配的核衣壳的抗体（mab 3120），虽然无法获得核衣壳核酸输入的证据，但可观察到核周积聚。如果核衣壳的分解不在细胞核内发生，与多聚酶连接的病毒基因组则会由于太大以至于无法自由扩散通过核膜孔复合体，此时必须经主动运输进入细胞核。其中一种可能（的主动运输方式）与拥有核酸结合区和核定位信号（NLS）序列的乙肝病毒核心抗原二聚体有关53。另一种可能（的主动运输方式）是多聚酶调节病毒基因组的最终输入。多聚酶-DNA复合体有效输送进入细胞核的观察结果可支持这一观点。然而，病毒基因组的去蛋白作用造成细胞质内的滞留118。最近，有研究显示乙肝病毒多聚酶的6-硫代嘌呤（TP）区包含

41、对乙肝病毒感染至关重要的功能性二连核定位信号124。3.6 复制 开环DNA到cccDNA的转换病毒侵入过程结束时，病毒基因组被输送进入细胞核。在这一阶段病毒基因组作为松环DNA存在。开环DNA由一条完整的负DNA链和一条不完整的正DNA链构成，负DNA链在5末端与病毒多聚酶P共价连接，正DNA链在其5末端有一个RNA寡核苷酸，这个RNA寡核苷酸可作为正链合成的引发剂。要实现病毒感染，病毒基因组必须在感染细胞内以一种稳定的形式存在。就乙肝病毒而言，病毒开环DNA转换为一种核游离基因型的共价闭合环状DNA，它在病毒复制中代表重要的胞内中间体，同时也作为成功实现感染的实验标志物125,126。就基

42、因组扩征以及共价闭合环状DNA形成而言，较短的正DNA链必须完整，两条链需要共价连接，而且必须清除阻碍性的末端修饰。关于病毒多聚酶和RNA引物是如何分别从负DNA链与正DNA链上得到清除，目前尚不完全明了。两项独立研究发现了一种无蛋白的开环DNA，它包含作为壳体化开环DNA的相同的核苷酸序列，但多聚酶不再与负DNA链结合，或许多聚酶只是在共价闭合环状DNA形成过程中担当中间产物127,128。使用树鼩原代肝细胞进行的感染实验表明，阻断病毒多聚酶的逆转录酶活性，将大大减少共价闭合环状DNA的形成73,74。此外，最近的体外实验显示，DDX3 DEAD-Box RNA解螺旋酶结合进入核衣壳将抑制逆

43、转录作用，并进一步导致双线性化DNA水平的下降129。将这些研究结果予以汇总可以发现，P蛋白在正DNA链完整化中发挥作用。然而，共价闭合环状DNA生成的详细过程仍不清楚，需要进一步的研究。 cccDNA 转录成为前基因组RNA转录核共价闭合环状DNA作为前基因组RNA合成的模板。前基因组RNA是指病毒复制的RNA中间体或其它一些亚基因组RNA。双顺反子前基因组RNA在病毒生命周期中有两个主要作用：首先，它是翻译和逆转录模板，前基因组RNA是一种超长转录物，包含正向重复序列1的二次拷贝、信号以及聚腺苷酸尾巴，可作为一种90kDa病毒多聚酶、21kDa核心蛋白以及一种24kDa前体早期抗原翻译的转

44、录物；其次，它是病毒负DNA链逆转录模板，因此与病毒复制无关。除了前基因组RNA外还有三种额外的亚基因组RNA，分别编码表面蛋白（2.4kb RNA和2.1kb RNA）和HBx蛋白(0.7kb RNA）81,130。所有嗜肝DNA病毒科的RNA转录均由宿主细胞多聚酶II处理。除野生型RNA以外，剪接变体RNA被翻译成为乙肝病毒剪接生成蛋白，并通过壳体化成为缺陷型病毒颗粒131。 逆转录乙型肝炎病毒和其它嗜肝DNA病毒科成员均使用前基因组RNA作为逆转录时的复制中间产物。首先，前基因组RNA-多聚酶复合体在装配衣壳的管腔内包装，而病毒多聚酶与壳体化信号结合，此信号是前基因组RNA上的顺式元件。

45、然而，信号和多聚酶是如何发生相互作用的目前还不十分清楚，但推测认为它在核心蛋白同型二聚体的招募过程中发挥作用，并最终通过自我装配导致衣壳形成。除了启动前基因组RNA多聚酶的壳体化外，信号与多聚酶相互作用也诱导逆转录，借此首先合成负DNA链，继而生成正DNA链，最终形成开环DNA。蛋白质引发机制对DNA合成的启动至关重要。与多聚酶共价连接的较短DNA寡核苷酸与信号结合并启动负DNA链合成。除这两个因素之外，几篇报道均认为核心蛋白对逆转录也是至关重要的，这几篇报道还明确指出，核心蛋白C末端装配区域的缺失或修饰将导致缺损DNA合成39,132-134。成熟后被分泌的乙肝病毒颗粒已经完成逆转录，此过程

46、在完整的核衣壳内发生且仅涉及DNA。在DNA基因组合成之后，核衣壳可继续病毒生命周期并与包膜蛋白发生相互作用135,136并作为感染性病毒颗粒分泌出去137，此外也可将开环DNA再次输送至细胞核并在其内建立共价闭合环状DNA池138。4. 病毒颗粒组装4.1 衣壳成熟RNA前基因组、乙肝病毒多聚酶和乙肝病毒核心抗原二聚体复合物形成之后，乙肝病毒核衣壳开始形成44,47。核衣壳装配完成后，RNA转换为单链DNA，接着转换为部分双链DNA（详见文献81）。与从被分泌的病毒中分离出来且仅包含成熟的部分双链DNA的核衣壳不同，细胞内核衣壳显示了病毒DNA合成的所有不同阶段。根据这些观察结果，可以断定早

47、期的包含RNA的衣壳（未成熟的核衣壳）没有合并进入病毒颗粒139。由此引出的问题是，与衣壳成熟作用有关联的衣壳结构是否发生变化，是否可以根据这种变化区分未成熟和成熟核衣壳。就鸭乙肝病毒和乙肝病毒而言，有报道称多聚酶的突变破坏了逆转录酶活性，导致未经包装的不成熟核衣壳积聚140, 141。根据鸭乙肝病毒系统的进一步实验发现，核衣壳的包装发生在复制周期的晚期阶段140。详细分析显示衣壳成熟与核衣壳脱磷酸化有关（图3）。有效的RNA包装需要发生磷酸化作用。就乙肝病毒而言，已有证据显示位于C末端区域的三个丝氨酸-脯氨酸-残基（第155位、第162位、第170位的丝氨酸）可发生磷酸化142。基于HepG

48、2细胞体外实验的进一步分析显示，乙肝病毒核心蛋白中的第162位丝氨酸是乙肝病毒RNA壳体化的充分必要条件。但是，乙肝病毒DNA复制中间体的生成既需要第162位的丝氨酸，也需要第170位的丝氨酸。核心的第155位丝氨酸对于开环DNA中间体的形成至关重要。丝氨酸转化为丙氨酸造成了对这些磷酸化位点的破坏，并最终导致这些未含有效数量DNA的核衣壳的核积聚。有研究推测，HBx在不同程度上支持在这些残基上发生的核心磷酸化作用，因而，对HBV复制有调节作用62。图3. 基因组包装和核衣壳成熟。RNA前基因组、乙肝病毒多聚酶和乙肝病毒核心抗原二聚体复合物形成之后，乙肝病毒核衣壳开始形成。有效的RNA前基因组包

49、装需要在核心蛋白C末端部分发生磷酸化。包含RNA的未成熟核衣壳转化为包含DNA的成熟核衣壳，与脱磷酸化作用和构象变化有关。包含RNA的未成熟核衣壳与成熟核衣壳之间的这些明显差异引起成熟核衣壳的包装。与这些残基磷酸化作用有关的激酶身份还不十分清楚。在体外实验基础之上，有人认为蛋白激酶C119或SPRK激酶家族成员可能参与其中143。通过详细质谱检验对鸭乙肝病毒衣壳磷酸化作用进行的分析显示，来自未成熟核衣壳的核心蛋白在至少6个区域发生了磷酸化， 而成熟的核衣壳则被完全脱去了磷酸化57。与此相一致，已观察到当这个鸭乙肝病毒核心磷酸化位点突变为丙氨酸后，将在最初期完全阻断逆转录。然而，天冬氨酸突变可使

50、得首链DNA完全合成，但在聚积成熟双链DNA方面存在缺陷。这一现象，一方面反映了天冬氨酸-核心突变体的不稳定性，而另一方面反映了对成熟次级链DNA合成的阻断作用144。基于来自乙肝病毒 58和鸭乙肝病毒144系统的数据断定，核衣壳成素的过程可描述为连续的磷酸化作用（未成熟核衣壳）和脱磷酸作用（成熟核衣壳）58。衣壳成熟过程中的这种脱磷酸作用，与包含RNA的核心和包含DNA的核心在结构方面的显著差异有关(图 3)。尤其是一个显著的变化影响了靠近刺突的疏水口袋，而这一疏水口袋为前S1区与核衣壳之间的相互作用所必需 12,145。这种口袋主要由残基构成，这些残基在突变后导致了异常的病毒分泌 146。

51、4.2 包装和出芽就C型逆转录病毒或慢病毒属而言，具有损坏包膜蛋白结构的突变体仍能释放，并覆盖脂质双层。与此不同，就乙肝病毒而言，成熟核衣壳的包装严格依赖于病毒表面蛋白的存在。然而，已显示乙肝病毒表面中蛋白与病毒复制无关89,147。表面大蛋白与表面小蛋白的形成则是必需的11,148。除此之外，病毒颗粒形成需要部分表面大蛋白的preS区面向细胞质 14。分泌信号与表面大蛋白N末端的融合导致表面大蛋白分子的专一性形成，合成的表面大蛋白分子将preS区暴露于内质网管腔。这样可形成亚病毒颗粒16，但阻碍了病毒颗粒的分泌24,149。来自鸭乙肝病毒系统的研究结果支持这种观察现象 150,151。有研究

52、发现核衣壳的包装需要乙肝病毒大蛋白。大蛋白的缺失造成衣壳被输送至细胞核，以及病毒基因组的再次输入与扩增。就鸭乙肝病毒而言，有人认为大蛋白preS区的第116位至第137位氨基酸对于病毒病毒组装至关重要152；而就乙肝病毒而言，大蛋白preS区的第103位至第124位氨基酸对于病毒组装至关重要（基因型不同时也可能是第92位至第113位氨基酸） 24。有研究推测这部分前S1区与衣壳在包装过程中发生相互作用。这种推测得到以下观察现象的支持，即发生在这部分前S1区内的突变消弱了衣壳包装。除此之外，HBV前S1区衍生肽段与重组肽段的体外结合分析可支持这一观点153 (E. Hildt未发表的结果)。除面

53、向细胞质的大蛋白preS区以外，在S区的跨膜区1和跨膜区2之间有一个短的回路（loop环），这一回路面向细胞质并能与核衣壳发生相互作用 12,13,153,154。此区域内的缺失抑制了病毒颗粒形成，而亚病毒颗粒的生成不受影响。为了鉴别对病毒包装至关重要的核衣壳残基，一些研究中对大量天然和人工突变体进行了分析。在这些实验的基础之上，可断定刺突尖端似乎对衣壳包装没有影响 146。与此相反，已观察到与刺突尖端结合的肽段可阻碍成熟病毒颗粒分泌 155。由蔗糖密度梯度离心作用纯化的乙肝病毒颗粒，经冷冻电子显微镜观察支持如下结论，即刺突尖端通过静电相互作用与乙肝病毒表面抗原发生相互作用13。 乙肝病毒核心

54、抗原的突变进一步显示，在刺突底端周围和刺突之间丛林中聚集的氨基酸残基对于核衣壳与包膜间的相互作用至关重要146。来自经氯化铯纯化的乙肝病毒颗粒电子显微镜结果支持这种假说12，而经蔗糖梯度纯化的病毒颗粒13电子显微镜结果无法表明在这些位置发生了稳定的包膜接触。成熟肝DNA病毒科核衣壳在细胞质中形成。就鸭乙肝病毒而言，已有研究显示，成熟的核衣壳可粘附至胞内膜。这种粘附不需要包膜蛋白的存在。未成熟核衣壳不发生结合作用156。目前还不了解调节成熟核衣壳输送至内质网后、高尔基体腔前的确切机制31，而包装就是发生在这一阶段。就逆转录病毒和一些包膜RNA病毒而言，有研究显示来自质膜的出芽依赖于宿主功能，这些

55、功能与蛋白质分选成为晚期胞内多泡体（MVBs）有关157。 通过显性负性突变体AIP1/ALIX与VPS4B的共表达对不同种类多泡体蛋白进行抑制，研究结果显示包膜乙肝病毒颗粒的有效出芽和释放需要多泡体的功能。除此之外，乙肝病毒颗粒和亚病毒颗粒均通过具有独立宿主因素需求的特殊途径得以释放136。References and Notes1. Locarnini, S. Molecular virology of hepatitis B virus. Semin. Liver Dis. 2004, 24, 3-10.2. Lupberger, J.; Hildt, E. Hepatitis B vi

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