基因工程DNA文库构建

1、基因工程DNA文库构建构建基因文库的基本程序：构建基因文库的基本程序： 提取研究对象基因组提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器片段，或提取组织或器官的官的mRNA并反转录成并反转录成cDNA； DNA片段或片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成重组与经特殊处理的载体连接形成重组DNA； 重组重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌； 阳性重组菌落或噬菌斑的选择。阳性重组菌落或噬菌斑的选择。第一节第一节 基因组基因组DNA文库的构建文库的构建一、基因组一、基因组DNA文库的类型和发展文库的类型和发展 质粒文库

2、质粒文库 噬菌体文库噬菌体文库 黏粒文库黏粒文库 人工染色体文库人工染色体文库 亚基因组文库亚基因组文库鸟枪法（霰弹法）：利用机械剪切力和超声波等物理鸟枪法（霰弹法）：利用机械剪切力和超声波等物理方法或限制性核酸内切酶酶切等生化方法将生物方法或限制性核酸内切酶酶切等生化方法将生物chr.打打断，随后通过断，随后通过T4 DNA连接酶把这些片段与适当的质粒连接酶把这些片段与适当的质粒载体进行重组，转化受体菌后进行无性繁殖，获得一载体进行重组，转化受体菌后进行无性繁殖，获得一大群含不同外源大群含不同外源DNA片段的克隆，再用简便的筛选方片段的克隆，再用简便的筛选方法从众多的转化菌株中筛选出含有某一

3、目的基因的菌法从众多的转化菌株中筛选出含有某一目的基因的菌株，从中获得所要的基因。株，从中获得所要的基因。代表性：代表性：指文库中所有克隆所携带的指文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段 DNA 。代表。代表性是衡量文库质量的一个很重要的指标。性是衡量文库质量的一个很重要的指标。文库构建策略：文库构建策略：采用部分酶切或随机切割的方法来消化染色体采用部分酶切或随机切割的方法来消化染色体 DNA ，以保证克隆的随机性，保证每段，以保证克隆的随机性，保证每段 DNA 在文库中出

4、现的频率均等；在文库中出现的频率均等；提高文库所含基因组提高文库所含基因组 DNA 的总容量，通常用覆盖基因组的倍数来衡量。的总容量，通常用覆盖基因组的倍数来衡量。二、文库的代表性和随机性二、文库的代表性和随机性三、基因组三、基因组DNA文库构建流程文库构建流程 载体的制备；载体的制备； 高纯度大分子量基因组高纯度大分子量基因组 DNA 的提取；的提取； HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离（的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGE size selection）；）； 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； 重组克隆的挑取和保存。重组克隆的

5、挑取和保存。1基因组基因组 DNA 文库的载体制备文库的载体制备 载体的制备要求：载体的制备要求：纯度高；纯度高；去磷酸化好。去磷酸化好。2高质量大分子量基因组高质量大分子量基因组 DNA 的提取和部分酶切的提取和部分酶切 提取的基因组提取的基因组 DNA 要求保存完整。要求保存完整。 分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。3文库的连接转化或包装侵染文库的连接转化或包装侵染 在电转化和包装侵染过程中，首先选择转化效率高的感受态细胞或效在电转化和包装侵染过程中，首先选择转化效率高的感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白；同时，研究表明对连接产物进

6、行脱盐处理也价高且质量稳定的包装蛋白；同时，研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率。另外，对于电转化而言，选择合适的转化电压对可以明显地提高其效率。另外，对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入片段的不同插入片段的 DNA 的转化效率也有所不同。的转化效率也有所不同。4文库的质量检测文库的质量检测 文库的平均插入片段长度是通过文库的平均插入片段长度是通过 PFGE 电泳检测一定数目的重电泳检测一定数目的重组子的插入片段大小所得平均值。美国的研究机构对组子的插入片段大小所得平均值。美国的研究机构对 BAC 文库，一文库，一般要求植物的在般要求植物的在 130kb 左右，而动物的

7、在左右，而动物的在 150kb 左右。左右。插入效率：有插入片段的克隆在所有检测的克隆中所占的比例。插入效率：有插入片段的克隆在所有检测的克隆中所占的比例。基因组覆盖倍数平均插入片段长度基因组覆盖倍数平均插入片段长度克隆数克隆数/基因组基因组 DNA 的长度的长度（一般是约数（一般是约数 ）；）； 基因组覆盖度是指文库中的克隆覆盖基因组的范围，检测时是通过选基因组覆盖度是指文库中的克隆覆盖基因组的范围，检测时是通过选择一定数目的已知的单拷贝的基因作探针来筛选文库。由于所使用的每择一定数目的已知的单拷贝的基因作探针来筛选文库。由于所使用的每个探针筛选的克隆数目即表明文库中对该基因位点的覆盖倍数，

8、因此，个探针筛选的克隆数目即表明文库中对该基因位点的覆盖倍数，因此，基因组覆盖倍数又等于所有探针筛到的阳性克隆的总个数基因组覆盖倍数又等于所有探针筛到的阳性克隆的总个数/使用的总探使用的总探针数的比值针数的比值 第二节第二节 cDNA文库的构建文库的构建 cDNA 文库中的外源文库中的外源 DNA 片段是互补片段是互补 DNA （complementary DNA , cDNA）。）。 cDNA 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经体外反转录后形成的双链经体外反转录后形成的双链 cDNA 。 cDNA 文库代表生物的某一特文库代

9、表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。 cDNA 文库构建步骤：文库构建步骤： 细胞总细胞总 RNA 的提取和的提取和 mRNA 分离；分离； 第一链第一链 cDNA 合成；合成； 第二链第二链 cDNA 合成；合成； 双链双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。 mRNA 在总在总 RNA 中所占比例很小，因此从总中所占比例很小，因此从

10、总 RNA 中富集中富集 mRNA 是构是构建建 cDNA 文库和其它应用所必需进行的步骤。文库和其它应用所必需进行的步骤。 目前目前mRNA的纯化的纯化 方法：在固体支持物表面共价结合固定一段由脱方法：在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸 oligo（dT）链，由它与链，由它与 mRNA 的的 Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住）尾巴杂交，从而吸附固定住 mRNA ，进而将，进而将 mRNA 从其它组从其它组分中分离出来。分中分离出来。1mRNA 的完整性的完整性 指导合成高分子量蛋白质的能力；指导合成高分子量蛋白质的能力； 指

11、导合成目的多肽的能力（利用免疫共沉淀和指导合成目的多肽的能力（利用免疫共沉淀和SDS-PAGE）；）； mRNA 的大小（的大小（500bp-8kb，多数，多数1.5-2kb）；）； 总总 mRNA 制剂指导合成制剂指导合成 cDNA 第一链长分子的能力。第一链长分子的能力。 一、一、 mRNA 的分离的分离3mRNA 的富集的富集 3.1 按大小对按大小对 mRNA 进行分级分离进行分级分离 3.2 cDNA 的分级分离的分级分离近年来多采用此方法，特别是大近年来多采用此方法，特别是大 mRNA ，可避免降解，可避免降解 mRNA , agarose 分离大小易辨。分离大小易辨。 3.3 多

12、聚核糖体的免疫学纯化法多聚核糖体的免疫学纯化法用抗体来纯化合成的目的多肽的多聚核糖体。用抗体来纯化合成的目的多肽的多聚核糖体。 免疫亲和柱免疫亲和柱/ A蛋白蛋白-Sepharose 柱，单克隆抗体把正在合成新生链柱，单克隆抗体把正在合成新生链的多聚核糖体结合到的多聚核糖体结合到 A 蛋白蛋白-spharose 柱上，随后用柱上，随后用 EDTA 解离下来，解离下来，通过通过 oligo（dT）层析分离）层析分离 mRNA 。此法分离的。此法分离的 mRNA 只占总只占总 mRNA 的的 0.01-0.05% 。2mRNA 的丰度的丰度 高丰度高丰度 mRNA ：在特定细胞中占：在特定细胞中占

13、 50-90%，如：免疫球蛋白，如：免疫球蛋白 。 低丰度低丰度 mRNA ：含量：含量 0.5% 被称为低丰度或稀有被称为低丰度或稀有 mRNA 。二、二、cDNA 第一链的合成第一链的合成常用的反转录酶：常用的反转录酶： AMV （来自禽成髓细胞瘤病毒）（来自禽成髓细胞瘤病毒） MMLV （来自（来自 Moloey 鼠白血病病毒）鼠白血病病毒）依赖于依赖于 RNA 的的 DNA 聚合酶，有聚合酶，有 5-3 DNA 聚合酶活性。聚合酶活性。合成合成 DNA 常用的引物：常用的引物： Oligo（dT）和随机引物。）和随机引物。 Oligo（dT）引）引物一般包含物一般包含 1020 个脱氧

14、胸腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的个脱氧胸腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的引物共同组成，随机引物一般是包含引物共同组成，随机引物一般是包含 610 个碱基的寡核苷酸短片个碱基的寡核苷酸短片段。段。 Oligo（dT）引导的）引导的 cDNA 合成是在合成是在 cDNA 的合成过程中加入高浓度的的合成过程中加入高浓度的 Oligo（dT）引物，）引物， Oligo（dT）引物与）引物与 mRNA 的的 3 末端的末端的 poly（A）配）配对，引导反转录酶以对，引导反转录酶以 mRNA 为模板合成第一链为模板合成第一链 cDNA 。这种。这种 cDNA 合成的合成的方法在方法在 cDNA 文

15、库构建中应用极为普遍，其缺点主要是由于文库构建中应用极为普遍，其缺点主要是由于 cDNA 末端存末端存在较长的在较长的 poly（A）而影响）而影响 cDNA 测序。测序。 随机引物引导的随机引物引导的 cDNA 合成是采用合成是采用 610 个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定定 mRNA 并作为反转录的起点。由于随机引物可能在一条并作为反转录的起点。由于随机引物可能在一条 mRNA 链上有多个链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的 mRNA 分子的分子的 5-端序列。随机引物端序列。随

16、机引物 cDNA 合成的方法不适合构建合成的方法不适合构建 cDNA 文库，一般用于克隆文库，一般用于克隆特定特定 mRNA 的的 5 末端，如末端，如 RT-PCR 和和 5-RACE 。 1自身引导法：自身引导法： 首先用氢氧化钠消化杂合双链中的首先用氢氧化钠消化杂合双链中的 mRNA 链，解离的第一链链，解离的第一链 cDNA 的的 3-末端就会形成一个发夹环（发夹环的产生是第一链末端就会形成一个发夹环（发夹环的产生是第一链 cDNA 合成时的特性，原因至今未知，据推测可能是与帽子的特殊结构相合成时的特性，原因至今未知，据推测可能是与帽子的特殊结构相关），并引导关），并引导 DNA 聚合

17、酶复制出第二链，此时形成的双链之间是连聚合酶复制出第二链，此时形成的双链之间是连接在一起的，再利用接在一起的，再利用 S1 核酸酶将连接处（仅该位点处为单链结构）核酸酶将连接处（仅该位点处为单链结构）切断形成平端结构可以进行连接。切断形成平端结构可以进行连接。三、三、cDNA 第二链的合成第二链的合成2置换合成法：置换合成法：RNaseH：将：将mRNAcDNA 杂合双链中的杂合双链中的 mRNA 链切割成很多的链切割成很多的小片段；小片段；大肠杆菌大肠杆菌 DNA 聚合酶聚合酶 ：以形成的小片段为引物，以第一链：以形成的小片段为引物，以第一链 cDNA 为模板合为模板合成一段段互补的成一段段

18、互补的 cDNA 片段。片段。 DNA 连接酶：合成的这些小连接酶：合成的这些小cDNA片段被连接成一条链。片段被连接成一条链。3引导合成法：引导合成法： 本方法是本方法是 Okayama 和和 Berg 1982 提出的。首先是制备一端带有提出的。首先是制备一端带有 Poly（dG）的片段）的片段 和带有和带有 Poly（dT）的载体片段）的载体片段 ，并用片，并用片段段 来代替来代替 Oligo（dT）进行）进行 cDNA 第一链的合成，在第一链第一链的合成，在第一链 cDNA 合成后直接采用末端转移酶（合成后直接采用末端转移酶（TdT）在第一链）在第一链 cDNA 的的 3-端端加上一段

19、加上一段 Poly（dC）的尾巴，同时进行酶切创造出另一端的粘端，）的尾巴，同时进行酶切创造出另一端的粘端，与片段与片段 一起形成环化体，这种环化了的杂合双链在一起形成环化体，这种环化了的杂合双链在 RNaseH 、大肠杆菌大肠杆菌 DNA 聚合酶聚合酶 和和 DNA 连接酶的作用下合成与载体联系连接酶的作用下合成与载体联系在一起的双链在一起的双链 cDNA 。其主要特点是合成全长。其主要特点是合成全长 cDNA 的比例较高，的比例较高，但操作比较复杂，形成的但操作比较复杂，形成的 cDNA 克隆中都带有一段克隆中都带有一段 Poly（dC）/（dA），对重组子的复制和测序都不利。），对重组子

20、的复制和测序都不利。 4引物衔接头合成法引物衔接头合成法第一链合成后直接采用末端转移酶在第一链第一链合成后直接采用末端转移酶在第一链 cDNA 的的 3-端加上一段端加上一段 Poly（dC）的尾巴，然后用一段带接头序列的的尾巴，然后用一段带接头序列的 Poly（dG）短核苷酸链作引物合成互补的）短核苷酸链作引物合成互补的 cDNA 链，接头序列可以是适用于链，接头序列可以是适用于 PCR 扩增的特异序列或用于方便克隆的酶扩增的特异序列或用于方便克隆的酶切位点的序列。这一方法目前已经发展成切位点的序列。这一方法目前已经发展成 PCR 法构建法构建 cDNA 文库的常用方法。文库的常用方法。 c

21、DNA 克隆时常出现丢失末端序列的现象，需较长时间获得全长克隆时常出现丢失末端序列的现象，需较长时间获得全长 cDNA 克克隆。隆。 cDNA 克隆中克隆中, 得到了不完整的片段得到了不完整的片段, 可采用此方法获得可采用此方法获得 3 末端和末端和 5 末末端的序列。工作原理见后图。筛选文库时一般只能回收一个或几个端的序列。工作原理见后图。筛选文库时一般只能回收一个或几个 cDNA 克隆，克隆， 而而 RACE 可产生大量独立克隆。引物可产生大量独立克隆。引物 GSP1 根据已经得到的不完整根据已经得到的不完整的的 cDNA 的序列设计。的序列设计。 （3） RACE（ random amp

22、lification of cDNA ends） 第三节第三节 基因克隆的筛选策略基因克隆的筛选策略 一般来说，这一筛选过程的难易程度，主要取决于所一般来说，这一筛选过程的难易程度，主要取决于所采用基因的克隆方案和目的基因的性质与来源。从文库中采用基因的克隆方案和目的基因的性质与来源。从文库中筛选目的基因的方法主要有：核酸杂交法、特异性抗原的筛选目的基因的方法主要有：核酸杂交法、特异性抗原的免疫学检测法、免疫学检测法、PCR筛选法。筛选法。 基因克隆的本质：从文库中筛选目标克隆，重点在筛选。基因克隆的本质：从文库中筛选目标克隆，重点在筛选。常见筛选工具：探针（常见筛选工具：探针（probe）

23、狭义：核酸，抗体狭义：核酸，抗体 广义：还包括其他筛选手段。广义：还包括其他筛选手段。 生物体的表型特征由控制其性状的基因编码。因此，可以通过生物体的表型特征由控制其性状的基因编码。因此，可以通过观察表型的变化来筛选目的基因。表型筛选法就是根据目的基因编观察表型的变化来筛选目的基因。表型筛选法就是根据目的基因编码比较特殊的功能，并且载体的帮助下可以在宿主菌（如大肠杆菌）码比较特殊的功能，并且载体的帮助下可以在宿主菌（如大肠杆菌）中表达该基因，表现出其特殊的功能所决定的表型性状来，这样就中表达该基因，表现出其特殊的功能所决定的表型性状来，这样就很容易通过导入的基因带来新的功能或恢复其缺失的功能来

24、确定目很容易通过导入的基因带来新的功能或恢复其缺失的功能来确定目的基因。的基因。一、表型筛选法一、表型筛选法 抗性基因：抗生素抗性基因、抗重金属抗性基因抗性基因：抗生素抗性基因、抗重金属抗性基因 分解基因：苯环化合物、分解酶分解基因：苯环化合物、分解酶 功能活性：杀虫、酶功能活性：杀虫、酶 启动子启动子/复制子：复制子： 功能缺失：在获得相应突变体的前提下，以此突变体作为宿主，功能缺失：在获得相应突变体的前提下，以此突变体作为宿主，将野生型的将野生型的DNA导入后检测回复突变（如：营养缺陷型相关的基导入后检测回复突变（如：营养缺陷型相关的基因）。因）。 当目标基因是未知功能的基因或一些不能在原

25、核生物中表达当目标基因是未知功能的基因或一些不能在原核生物中表达的真核生物的基因，可以利用的可能只是该基因的部分序列、同的真核生物的基因，可以利用的可能只是该基因的部分序列、同源基因片段或不完整的蛋白质产物，此时就必须考虑其它的方法源基因片段或不完整的蛋白质产物，此时就必须考虑其它的方法来筛选。杂交筛选法是应用最为广泛的筛选目标基因克隆的一种来筛选。杂交筛选法是应用最为广泛的筛选目标基因克隆的一种方法。方法。二、杂交筛选二、杂交筛选 同源同源DNA探针：探针： 高度保守的基因高度保守的基因 rRNA基因基因 邻近种属的相应基因邻近种属的相应基因 相应基因的序列比较相应基因的序列比较 合成寡核苷

26、酸：合成寡核苷酸： 蛋白质蛋白质N-末端末端aa序列序列 简并探针简并探针 根据密码子的使用频率，合成猜测体探针根据密码子的使用频率，合成猜测体探针 设计两组简并探针，用第二个探针对第一次筛选的阳性克隆子作设计两组简并探针，用第二个探针对第一次筛选的阳性克隆子作第二次杂交第二次杂交实验组实验组mRNA & 对照组对照组mRNA 分别制备探针（分别制备探针（mRNA或或cDNA) 分别筛选含目的基因的分别筛选含目的基因的cDNA文库文库 阳性菌落阳性菌落x光底片显色光底片显色 比较比较x光底片和对照平板，挑出含目的基因的菌落光底片和对照平板，挑出含目的基因的菌落 鉴定目的基因鉴定目的基因

27、 (一一) 差别杂交差别杂交 (differential hybridization )优点优点 - 简便、直观简便、直观缺点缺点 - 敏感性不高，难以获得低丰度差异表达基因敏感性不高，难以获得低丰度差异表达基因 - 膜杂交筛选工作量大，信号强度可比性不佳膜杂交筛选工作量大，信号强度可比性不佳 实验组实验组mRNA&对照组对照组mRNA 反转录为单链反转录为单链cDNA（量少）（量少）- 生物素标记生物素标记mRNA（量多）（量多） 杂交杂交(约约1:20) 生物素标记生物素标记mRNA：cDNA杂合子杂合子 与链球菌抗生物素蛋白进行交联反应与链球菌抗生物素蛋白进行交联反应 生物素标记

28、生物素标记mRNA：cDNA杂合子交联于链球菌抗生物素蛋白上杂合子交联于链球菌抗生物素蛋白上 去双链结构去双链结构 单链单链cDNA 制备差减探针制备差减探针 & 构建差减构建差减cDNA文库文库 差减差减cDNA文库筛选文库筛选 鉴定目的基因鉴定目的基因(二二) mRNA 减法杂交减法杂交（subtractive hybridization)原理：原理：SSH是差减杂交与是差减杂交与PCR结合的简单、快速分离差异基因的方法。结合的简单、快速分离差异基因的方法。其运用杂交动力学原理，即丰度高的单链其运用杂交动力学原理，即丰度高的单链DNA在退火时产生同源杂交在退火时产生同源杂交的速度快

29、于丰度低的单链的速度快于丰度低的单链DNA，从而使不同丰度的单链，从而使不同丰度的单链DNA得到均衡；得到均衡；抑制抑制PCR则利用链内退火优于链间退火的优点，使非目的基因片段两则利用链内退火优于链间退火的优点，使非目的基因片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构, 无法作为模板与引无法作为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增，从而使目的基因得物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增，从而使目的基因得到富集、分离。到富集、分离。（三）（三） 抑制性差减杂交抑制性差减杂交(suppressive subtractive hyb

30、ridization, SSH)方法：方法： 提取实验组和对照提取实验组和对照组组mRNA合成双链合成双链cDNA，经识别，经识别4碱碱基的限制性内切酶切基的限制性内切酶切割；割； 实验组实验组cDNA平均平均分为分为2份，分别连接份，分别连接2个接头；个接头； 进行进行2轮差减杂交轮差减杂交和抑制和抑制PCR； 获得富集的目的获得富集的目的基因。基因。检测组检测组 (Tester) 含目的基因含目的基因cDNA，加接头，加接头驱逐组驱逐组 (Driver) 不含目的基因不含目的基因cDNA，不加接头，不加接头 * 接头含接头含PCR 引物引物正向正向SSH: 易感者易感者(Tester) +

31、 不易感者不易感者(Driver) 易感者特异表达或高表达基因易感者特异表达或高表达基因 反向反向SSH: 不易感者不易感者(Tester) + 易感者易感者(Driver) 不易感者特异表达或高表达基因不易感者特异表达或高表达基因优点：采用两次差减杂交和两次优点：采用两次差减杂交和两次PCR，保证了高特异性，保证了高特异性 (假阳性率可假阳性率可降至降至6); 在杂交过程中可使不同丰度基因均衡化，从而获得低丰度在杂交过程中可使不同丰度基因均衡化，从而获得低丰度差异表达基因差异表达基因;操作相对简便，是目前分离新基因的主要方法。操作相对简便，是目前分离新基因的主要方法。缺点：起始材料需要缺点：

32、起始材料需要g级量级量mRNA; SSH差减克隆片段较小，获取差减克隆片段较小，获取cDNA全全长序列有一定难度。长序列有一定难度。三、免疫筛选三、免疫筛选 免疫筛选法和核酸杂交的方法类似，只是其使用的探针不是免疫筛选法和核酸杂交的方法类似，只是其使用的探针不是核酸，而是特异性的抗体。适合免疫杂交法筛选的外源基因首先核酸，而是特异性的抗体。适合免疫杂交法筛选的外源基因首先要在宿主细胞中存在抗原蛋白的表达，用于筛选的要在宿主细胞中存在抗原蛋白的表达，用于筛选的 DNA 文库必须文库必须是表达文库，通常是原核生物的基因组是表达文库，通常是原核生物的基因组 DNA 文库和真核生物的文库和真核生物的

33、cDNA 表达文库。而且，所检测的对象为宿主中不编码的基因或宿表达文库。而且，所检测的对象为宿主中不编码的基因或宿主中缺失表达的基因。主中缺失表达的基因。四、高表达基因四、高表达基因 高丰度高丰度mRNA，如用苯肼做了贫血处理的兔网织红细胞中，如用苯肼做了贫血处理的兔网织红细胞中，血红蛋白血红蛋白mRNA的含量占绝大多数的含量占绝大多数 mRNA3末端有末端有12种可能的序列；种可能的序列； 以此以此12种引物引导种引物引导cDNA第一链合成；第一链合成； 以以10nt随机引物引导随机引物引导cDNA第二链合成，可产生第二链合成，可产生50-100条条100-500bp的条带；的条带； 12种

34、锚定引物和种锚定引物和20种随机引物组成种随机引物组成240组引物，产生约组引物，产生约20000种种DNA条带。条带。五、五、mRNA差别显示差别显示 酵母双杂交系统由酵母双杂交系统由Fields和和Song等首先在研究真核基因转录调控等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，中建立。典型的真核生长转录因子， 如如GAL4、GCN4、等都含有二、等都含有二个不同的结构域个不同的结构域: DNA结合结构域结合结构域可与可与DNA序列的特定位点即上序列的特定位点即上游激活序列结合；转录激活结构域游激活序列结合；转录激活结构域协助协助RNA聚合酶聚合酶复合体激活复合体激活上游激活序列（上游激活序列（UAS）下游基因的转录。这两个结构域的功能是独立）下游基因的转录。这两个结构域的