克隆载体与表达载体

1、克隆载体克 隆 载 体基本性质基本特征（或载体的构建）原理机制常用的载体质粒载体质粒能利用寄主细胞的 DNA复制系统进行自主 复制；不相容性；可转 移性（基因工程中采用 非接合性质粒）（1） 具有合适的复制起始位点（ORI）（2） 具有合适的选择性标记基因（ 3） 若干限制性切酶的单一位点（ 4）具有 较小的分子量和较高的拷贝数。当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体 菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能 在含有抗菌素的培养基 （选择培养基）中生长。（抗 菌素选择原理）PSC101ColE1PBR322 pUC18 pUC19 TA载体噬 菌 体 载 体入噬 菌体其DNA两端的5

2、'末端 各带有12个碱基的互补 单链，即cos位点。有 可替代区，即非必需区。 用外源DNA片段替代这 个区域，不会影响噬菌 体颗粒的形成。（1）基因组大小；去除非必需区，建立 外源DNA片段的克隆或替换位点（2） 在DNA的非必需区插入选择标记：lacZ 基因；基因c I失活（cl基因：溶源 过程控制基因）；Spi筛选（野生型 入 噬菌体在带有 P2原噬菌体的溶源性 E.coli中 的生长会受到限制的表型， 称作Spi+ ，即对P2噬菌体的干扰敏 感）1）通过裂解过程增殖载体2）载体与外源DNA的酶切3）外源DNA与载体的连接4）重组噬菌体的体外 包装5）包装噬菌体颗粒的感染6）筛选

3、（入噬菌体载体的克隆原理）插入式载体置换型载体（取代型载 体）M13噬 菌体 载体M13噬菌体的基因组为 单链DNA。噬菌体颗粒 的大小受其DNA端点制 约的，不存在包装限制。 只感染雄性大肠杆菌基因间隔区（in terge nic regio n, IG区）基因II与基因IV之间存在一段 507bp的基因间隔区，含有复制起始位 点，是实施改造、构建人工载体的重点 区域。IG区只有一个Bsu I切点。（2）加入酶切位点，在IG区加入单一 切酶位点。M13mp1在IG区插入一个大 肠杆菌的LacZ'（-肽序列）。使克隆1、以（+）链DNA为摸板，合成互补（-）链，该 双链称复制型 DNA

4、（ RFDNA。2、RFDNA在宿主细胞 能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。3、单链特异的DNA吉合蛋白结合在 （+ ）链上，从而阻 断了其互补链，即（）链的合成，这样，细胞就 会不断的合成（+）链DNA 4、游离出来的（+）链 DNA先与基因V的编码产物形成特异的 DNA-蛋白质 复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋M13mpn n代表系列数 字对M13mp1的改 进加上常用 的酶切位点。M13mp2LacZ'5'端的DNA片段以特定单链的形式输出受体 细胞外，M13重组分子筛选简便， 被M13 噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成 混浊斑，易于辨认挑选。而且

5、重组分子 越大，混浊斑的混浊度亦越大 但 M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小， 只有1.5 kb白质从（+） DNA链上脱落下来，余下的 M13（ +）链 DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程 中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。（M13噬菌体产生单双链DNA的机制）的第13个核 苷酸G突变成 A,产生了一 个EccR I切 占八、噬 菌 体- 质 粒 杂 合 载 体黏粒载体考斯质粒是一类人工构 建的含有入-DNAcos序 列和质粒复制子的的特 殊类型载体。能像 -DNA那样进行体外包 装，并咼效转染受体细 胞；能像质粒那样在受 体细胞中自主复制具有 较咼容量的克隆能力： 45kb

6、;具有与同源性序 列的质粒进行重组的能 力粘粒（cosmid ）是带有 cos序列的质 粒。cos序列是噬菌体DNA中将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。黏粒的组成包括质粒复制起点（colEI ）,抗性标记（amp）, cos 位 点，因而能象质粒一样转化和增殖。克 隆的最大DNA片段可达45kb 。有的 粘粒载体含有两个cos位点，在某种程度上可提高使用效率。设计构建的柯斯质粒一般长46kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具 有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌 体基因组，就可以冋外壳蛋白结合而被包装成类似 噬菌体入的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外

7、源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体入一样感 染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。噬菌 粒载 体能像质粒那样在受体细 胞中自主复制能像M13-DNA那样体外包装， 并高效转染受体细胞 装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb 通过克隆双链 DNA能获 得同等长度的单一单链DNA噬菌粒载体综合了质粒载体和M13噬菌体载体优点，含有ColEl复制起始位点、 抗生素抗性选择标记和丝状体噬菌体 DNA间隔区（含有噬菌体DNAM制起始、 终止以及噬菌体颗粒形态发生所必需 的全部顺式作用元件）它具有质粒的复制起点、选择性标记、 多克隆位点等，方便 DNA的操作，可在 细胞稳定存在；又具有单

8、链噬菌体的复1.具有较小分子量基因组DNA可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作；2.编码一个 amP基因作为选择记号， 便于转化子的选择；3.拷 贝数含量高4.存在着一个多克隆位点区，因此多 种不冋类型的外源 DNA片段，不经修饰便可直接插 入到载体分子上；5.多克隆位点区阻断了大肠杆菌 lacZ基因的5'-端编码区，可按照IPTG显色反应 试验师选6. lacZ 基因是置于lac启动子的控制之 下，插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；PUC118 和PUC119重组操作简便，筛选容 易制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进 行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌 体7含

9、有质粒的复制起点，可复制形成大量的双链 DNA 分子8.带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅 助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；9.;在PUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的 核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一 个可转录克隆基因的正链 DNA另一个则可转录出负链DNA人工染色 体染色体具有复制功能， 利用染色体的复制元件 来驱动外源DNA片段复 制的载体称为人工染色 体载体其装载外源DNA的容量比质粒、噬菌体 和噬菌体-质粒杂合载体等有很大的拓 展，甚至可以跟染色体的大小相媲美。 人工染色体载体拷贝数少，制备困难， 通

10、常采取“穿梭载体”的策略来解决含有质粒载体所必备的第一受体（大肠杆菌）质粒复制起始位点，这样的载体在大肠杆菌可以按质粒复 制形式进行高拷贝复制，含有第二受体（如酵母）端粒（TEL）、DNAM制起始位点（ARS）和着丝粒（CEN） 以及合适的选择标记。载体在体外与目的DNA重组后转化到第二受体细胞，按照染色体复制的形式进 行复制和传递。筛选第一受体的克隆子一般采用抗 生素抗性选择标记；筛选第二受体的克隆子常用与 受体互补的营养缺陷型。酵母人工染 色体载体YAC 细菌人工染 色体载体BACP1噬菌体人 工染色体载体PAC质粒载体总结质粒 载 体类型长度选择标记克隆位点PSC101天然质粒，属严紧型

11、、低拷贝型9.09kb四环素抗性Tetr7 个克隆位点：EcoR I、Xho I、Pvu I、Hi nd III、BamH I、Sal I 、Sam I主要使用EcoR IColEI天然质粒，属松弛型多拷贝型6.3 kb大肠杆菌素（colicin ） E1 和对E1免疫的 基因（immEDEcoR I位于E1部，插入外源 DNA会导致E1失 活，使受体菌不能合成E1 （ColEI ），但仍然表现出对E1免疫型（ImmEl）pBR322兀件来源复制起点 oripMB1系列（来源于ColEI ）的高拷贝型复制起点 Ampr 基因pSP2124质粒的Amp基因Tet r基因pSC101的 Tetr基

12、因。4363bp氨卞冃霉素和四环素抗性24个克隆位点。其中9个会导致 Tetr基因失活（如BamH、Hi nd川、Sal I ）;3个会导致 Amp基因失活（Sca I、PvuI、Pst 1）。pUC系列（i ）来自pBR322质粒的复制起点（ori ）; （ii ）氨苄青 霉素抗性基因（ampr），但它不再含有原来的核酸切限制 酶的单识别位点；（iii ）大肠杆菌3 -半乳糖酶基因（lacZ ）的启动子及其编码a -肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ '基因；（iv ）位于lac Z'基因中的靠近 5'-端的一段多克隆位点（MCS区段，但它并不破坏该 基因的功能2

13、.7kbAmpicilli n 抗性和lacZ 的a肽互补（监白斑）相 结合。10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ '基因的5'端。TA载体耐热聚合酶可在 PCR产物的3'端加上一个非配对的 脱氧腺嘌呤核苷（A）。根据这一特点研制出线性TA质粒载体，其5'端各带有一个不配对的脱氧胸腺嘧 啶（T），用该载体可进行 PCR产物的直接克隆。TA载体构建：在 般质粒载体的基础上构建。方法1:先采用限制性切核酸酶酶切使质粒载体线性化，再通过K1enow片段将酶切的线性载体末端补平方法2:利用产生平末端的限制性切核酸酶酶切产生平末端，最后将线性化钝 末端质粒载体加 T

14、反应形成。目前有很多公司推出了TA质粒载体。入噬菌体载体入噬菌体载体分类插入式载体一种只具有一 个可供外源DNA 插入的克隆位 点的派生载体入噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。cl基因插入失活：如入gt10、入NM1149等载体，在cl基因上有EcoR I及Hind III 的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊 的噬菌斑。Lac Z 基因插入失活：如 charon16A载体，在非必须区段引入lac Z 基因，在lac Z 基因上有 EcoR I位点，插入失活后

15、利用X-gal法筛选（蓝白筛选）置换型载体（取代型载 体）具有成对的克 隆位点，在这 两个位点之间 的入DNA区段可 以被外源DNA 片段所取代。野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段这些载体是用Lac 5替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac 5作为选择标记使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli繁殖，并裂解 E.coli ,形成空斑。置换型入噬菌体是使用最广泛的载体。人工染类别元件优点酵母人工染色体 载体YAC是最常用来克隆 很大DNA片段（2Mb的系统。为构建YAC需要

16、结合四个短序列：即二个端粒、 一个着丝粒和一个 ARS元件，并将一适当大小的 外源DNA连接成一线性DNA分子，而端粒序列位 于正确的末端。YAC的构建有比在细菌中克隆的一些优点，因为某些真核 细胞的序列，特别是重复序列是难以甚至不可能在细菌中 繁殖的，酵母细胞却具有这样的能力色体细菌人工染色体 载体BAC是基于大肠杆菌 的F质粒构建 的，高通量低拷 贝的质粒载体每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标 记，一个来源于大肠杆菌F因子（致育因子）的严谨型控制的复制子oriS（ Shizuya et al.1992 ），个易于DNA复制的由ATP驱动的解 旋酶（RepE）以及三个确保低拷贝质粒精确

17、 分配至子代细胞的基因座（parA , parB ,和parC）以大肠杆菌为寄主，转化率高，构建BAC文库比YAC文库更容易；BAC载体以环型超螺旋状态存在，从大肠杆 菌中提取质粒较方便，而从酵母中分离DNA较困难；BAC的复制子来源于 F因子，可稳定遗传，嵌合及重组 现象少；可以通过菌落原位杂交来筛选目的基因，方便 快捷；BAC载体在克隆位点的两侧具有 T7和Sp6聚合酶 启动子，可以用于转录获得 RNA探针或直接用于插入片段 的末端测序。表达载体分类结构组成及表达兀件特点或优点备注质 粒 表 达 载 体原核表达载体1启动子、2转录终止子（防止克隆的外源基因表达干 扰载体的稳疋性）3核糖体结

18、合位点表达方式有： 组成型表达， 诱导型表达。 融合型表达， 分泌型表达。启动子类型：根据作用方式及功能分类组成 型启动子 组织特异启动子又称器官特异性启动子。 诱导型启动子酵母表达载体来自pBR322基本骨架含有该质粒复制起 始位点（ori） , lacZ 基因、bla 或 amp、tet 等基因。含有 URA3 HIS3、LEU2 TRP、LYS2与特定的宿主营养缺陷突变体互补筛GAP是组成型启动子。其余是诱导型启动 子。酵母表达载体多为穿梭载体 ：既可以 在大肠杆菌中繁殖，获得足够的载体DNA 进行体外操作，又可以在酵母中复制、 表由于原核生物和真核生物存在糖基化、 酰基化 等翻译后修饰

19、反应机制的差异， 真核基因的原 核表达难以获得有活性的蛋白。 酵母成为真核 表达的首选系统。选或利用 zeocin、basticidin （杀稻瘟菌 素）的抗性基因筛选。启动子有GAP AOXI、 AUGI 和 GAL1 等。达和选择。融合蛋白表达载体：于外源基 因插入位点的C端或N端插入了 1个6X His标签，或在5'端插入了 a -因子作 为分泌信号Ti质 粒 表 达 载 体一元 载体一兀载体就是含目的基因的中间表达载体 与改造后的受体（Ti质粒）通过同源重组所 产生的一种复合型载体，也称为共整合载 体。由于该载体的T-DNA区与Vir区紧密连 锁，也称为顺式载体（cis-vec

20、tor）Ti质粒是根癌农杆菌中发现的可引发植 物产生冠瘿瘤的质粒。根据冠瘿瘤合成的 冠瘿碱种类，Ti质粒可分为章鱼碱、农 杆碱、农杆菌素和琥珀碱4种不冋类型Ti质粒可分为 T-DNA Vir、Con和Ori 4 个功能区。T-DNA区是Ti质粒中能转 移到植物细胞的区域。Vir区 位于T-DNA区的上游，其表达产物可激活 T-DNA向植物细胞的转移， 这一个区域也 称为致病区。Con区该区含有与农杆菌之间接合转 移有关的基因（tra ），这些基因受佰主细 胞合成的冠瘿碱激活，使Ti质粒在细菌之间转移。Ori区 调控Ti质粒的自我复制，为复 制起始区构建的基本原理：引入分子质量较小的中间载体，将

21、欲转化的目的基因及抗性标记基因构建到中间载体上。将Ti质粒上T-DNA的致瘤基因全部去掉，仅 保留其两边界及与 T-DNA转移所必需的25个 碱基序列，构建成所谓卸甲载体。 在卸甲载体 的T-DNA区被删除致瘤基因位点插入中间载 体同源的质粒序列，将中间载体转入含有卸甲 载体的根癌农杆菌中，构建在中间载体上目的 基因可通过冋源重组整合到卸甲载体Ti质粒的T-DNA区，并与卸甲载体Ti质粒一起复制。二元 载体双兀表达载体系统主要包括两个部分：一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于 缺失了 T- DNA区域，完全丧失了致瘤作 用，主要是提供Vir基因功能，激活处于反 式位置上的T- DNA的转移。

22、另一部份是微 型Ti质粒，它在T- DNA左右边界序列之间 提供植株选择标记如NPTII基因以及Lac Z基因等。双兀载体系统的构建的原理是Ti质粒上的 Vir基因可以反式激活 T- DNA的转移。与共整合载体所不同的是， 它不依赖两个 质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能 在农杆菌独立复制双元表达载体构件方便，转化效率高于一 元载体。病 毒 表 达 载杆状病毒表 达载体杆状病毒表达系统的基本兀件：（1）启动子：多个启动子同时表达多个外源 基因。（2）poly A加尾信号：（3）冋源重组 序列。（4）穿梭载体必需兀件。除带有病毒 自身的复制起始位点外，还带有pUC质粒的重组蛋白具有完整的生

23、物学功能：接近天然蛋白。能进行翻译后的加工修饰： 研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方 面的理想模型。表达水平高：最高可使 目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50%。杆状病毒科病毒，杆状病毒颗粒，双链闭合环 状DNA病毒，专一性感染无脊椎动物将外源基因先克隆到转移载体上，再与病毒基因组共同转染细胞，通过细胞的同源重组获得 带有外源基因的重组病毒的策略。体复制子及以amp，可以在细菌进行扩增。（5） 筛选标记。 能容纳大分子的插入片段：上限未知。 能同时表达多个基因： 在同一细胞同时表达多个基因。能表达基因组DNA昆虫杆状病毒表达系统具有剪切的功能。对重组蛋白进行定位的功能： 如将核蛋白 转送到细胞核上

24、，膜蛋白则定位在膜上， 分泌蛋白则可分泌到细胞外等。腺病毒载体腺病毒 DNA末端结构突出特点1 ）带有100bp反向的末端重复序列（ITR），而且在 每一条单链的 5'-末端还共价地连接着末 端结合蛋白，对病毒的复制有重要作用。2） 当它从病毒颗粒中分离出来之时，便会自发地环化起来，尔后许多环形分子又聚合成多 聚体腺病毒载体是目前最为广泛应用的基因 载体，也是唯一基因药物的载体双链DNA的分子大小约为 36kb.可应用于1.基因治疗2.表达真核基因3. 研制疫苗首先构建一个含多克隆位点和筛选标志的转 移质粒，该质粒含有病毒基因组某段早期序 列；然后将一个含有启动子一外源基因-polyA

25、的表达盒插入到上述质粒中腺病毒E1、E3或E4至右侧的ITR区之间，构建成载有外源 基因的穿梭质粒。反 转 录 病 毒 载 体泡沫病毒类从5'端开始依次是：5'长末端重复序 列（5 ' -LTR），带有增强子和启动子序列； psi序列，又称“序列，是病毒包装所必 须的信号序列；gag,编码病毒衣壳蛋白； pol，编码反转录酶和整合酶（Int）:env,编码病毒颗粒外层包装蛋白；3'长 末端重复序列（3 ' -LTR）,带有poly A加尾 信号序列。一类含单链RNA的动物病毒。它的基因组 含有2条相同的正链RNA分子，包装成二 倍体病毒颗粒。（1）在大多

26、数情况下，反 转录病毒的肿瘤基因（onc）都能够在正常 的细胞中转录。2 ）反转录病毒的寄主围 相当广，包括无脊椎动物和脊椎动物。3） 反转录病毒具有强启动子， 外源基因可得 到有效表达。4）反转录病毒不但感染效 率高，而且不招致寄主细胞的死亡载体的构建：分离原病毒 DNA删去部分序列t组入选择 性标记基因、目的基因和调控兀件t克隆到含 有大肠杆菌复制起始位点的克隆载体t转化 大肠杆菌t获得反转录病毒克隆载体t辅助细胞系（包装细胞系）t扩增慢病毒类致癌 病毒 类SV40病毒型转化载体根据SV40 DNAS入敏感动物细胞的转方向， 分为早期转录区和晚期转录区。早期转录区包括与病毒感染相关的t抗原含有能够被真核细胞识别的有效的启 动子。有许多种动物病毒，在其感染周 期中都能够持续地复制，使其基因组拷贝猿猴空泡病毒 40（Simia n vacuolati ngvirus40, SV40）基因组是一种环形双链的DNA其大小仅有5243bp，很适于基因操作。导致人基因(smallT-antigen) 和 T抗原基因(large T-antigen)等；含有 BamHI等限制性切核酸酶识别位点；晚期转录区包括与病 毒壳蛋白合成相关的基因，