普通变形杆菌TWN3株DNA疫苗的初步研究.docx

1、普通变形杆菌TWN3株DNA疫苗的初步研究王娟械，辜文博】，冯军】，顾继锐械，吴江2,徐恒】，2(1.四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川成都610064；2.通威股份有限公司，四川成都610081)摘要：普通变形杆菌TWN3分离自死亡大口船菌的DNA文库已构建成功.通过免疫印迹法从文库中筛选到TWN3抗原片段PV<,将其克隆到真核表达载体pcDNA,上.构建DNA疫苗pcDNA3-PV4.肌肉注射免疫小版进行真核表达检测。免疫组织化学分析DNA疫苗在接种局部肌肉中抗原的表达.ELISA检测小鼠血清中的IgG及IFN-y含址。免疫pcDNA3-PV4疫苗的小鼠肌

2、肉细胞中检测到PV,相关抗原蛋白的表达.外周血中的IgG及IFN-y显著高于免疫pcDNA,组.对小鼠进行免疫保护试验.免疫DNA疫苗的小鼠对TWN3菌有免疫力.初步显示构建的DNA疫苗有一定效果.试验结果为鱼类水体试验提供了参考依据，同时随着TWN3株函DNA疫苗研究的深入，将对该疫苗最终大规模用于鱼类提供理论基础。关键词：普通变形杆菌TWN3株；DNA文库；PV,»DNA疫苗中图分类号：Q78文献标识码：A文章编号：1003-1111(2009)04-0205-04水产养殖业的快速发展，大规模高密度养殖造成水质恶化，导致水产养殖动物病害日趋严重。使用化学合成或抗生素类药防治疾病影

3、响水产品的品质和安全性并引起环境污染。采用减毒或灭活疫苗，重组亚单位疫苗及合成多肽疫苗进行防治虽然在生产实践中得到较大程度应用，然而在免疫方式、保护力等方面存在一定问题。核酸疫苗具抗原性强、保护时间长、制备容易等优点而成为研究热点。普通变形杆菌(P"£e"sw"/g"is)TWN3由实验室从四川绘科鱼类养殖场死亡的大口幼(Si-lurusmeridionalis)成鱼组织中分离得到，对小鼠有较强的致病性，病症与鱼类一致。这株菌的DNA文库已由实验室建立，文章构建了TWN3的DNA疫苗并对疫苗进行了初步研究。1材料与方法1.1主要试剂EcoRI/

4、1；DNAligase、小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)、异丙基-伊D硫代半乳糖(IPTG)；HRP标记羊抗兔IgG购自北京博奥公司；HRP标记羊抗鼠IgG购自中杉公司；普通变形菌TWN-3株菌的多克隆抗体经过免疫新西兰雄性兔获得，存于超低温冰箱待用；4-氯1紊酚为Sigma公司；硝酸纤维素膜为Pharmacia公司产品；氨苯青需素、牛血清白蛋白(BSA)、Tris为Amresco公司产品；酵母粉与胰蛋白豚为OXIDE公司产品；IFN-y检测试剂盒购于上海森雄科技实业有限公司；免疫组化所需试剂II/III抗:SP9710试剂盒及DAB-0031显色试剂盒购于福建迈新生物技术有限公司；其他相关试剂为

5、国产分析纯产品。1.2菌株、质粒及试验动物大肠杆菌(Escherichiaco4)JM109,质粒pUC18,pcDNA,为本实验室保存，TWN3为实验室分离鉴定。普通变形杆菌TWN3株DNA文库由本实验室保存。试验用昆明小鼠(Musmusculus)购自成都中医药研究所，质量为1520g,雄性。1.3试验方法1.3.1免疫印迹筛选普通变形杆菌TWN3株抗原相关基因或片断从已构建的普通变形杆菌TWN3株DNA文库中，参照文献4的方法先制备一个主板，待主板菌落长至34mm后，用已灭菌的硝酸纤维素膜复印主板，然后将该膜转移到含有异丙基仲D-硫代半乳糖昔(IPTG)(终浓度1.0mmol/L)、氨苯

6、青霉索(终质JR浓度100Fg/ml)的LB平板中于37C培养4h,诱导插入片断表达外源蛋白质。再将膜上的菌落于氯仿蒸汽中暴露15min,然后将膜放入裂解液裂解16h。裂解完成后，依次加入兔血清与偶连HRP的羊抗兔IgG进行杂交，然后显色定影得到阳性克隆。挑取主板上相应位置的阳性克隆接种于氨羊青霉素(100g/ml)的LB液体培养基扩大培养后，提取质粒并用EcoRI完全酶切进行进一步验证，得到普通变形杆菌TWN3株的保护性抗原基因片段PV”回收片段，同时送测序。1.3.2DNA疫苗的构建和鉴定收稿H期：2008-06-11.修回日期：2008-07-29.基金项目；四川省科技攻关项目(O5NG

7、OO2002-4),通威股份科技发展项目.作者简介，王始(1982-),女.硕士研究生，研究方向：微生物生物技术»E-maihstoncwjl982,通讯作者:徐恒(1964-),男，教授，研究方向：微牛.物1E-mail:xubcng®email,.pcDNA3能在真核哺乳动物细胞中高水平表达外源基因，具有多个限制性酶切位点。EcoRI完全酶PCDNA3,去稚酸化，将PV插入到PcDNA3的相应位点，经酶切及测序验证，证实DNA疫苗构建成功。小鼠试验验证DNA疫苗真核表达情况。1.3.3疫苗的大量制备将含质粒pcDNA3及pcDNA-PV,质粒的大肠杆菌分别接种于500m

8、lLB培养基中，摇菌过程中加入终质量浓度为100Mg/ml的氯霉素，大批最抽提方法参照文献4。紫外分光光度计测定质粒浓度，用0.85%生理盐水调整至终质量浓度500昭/ml。1.3.4DNA疫苗免疫小鼠为了验证DNA疫苗的真核表达情况，选用小鼠进行动物试验。小鼠分为2组，免疫pcDNA3的对照组和免疫pcDNA3-PV4的试验组，每组9只小鼠。免疫量为100'g/只，免疫时间为第0周、第2周、第4周，每次免疫的部位相同。免疫后第10<1、第20d、第30d每组分别取3只小鼠，眼部采血，分离血清测抗体及IFN-y含量。1.3.5免疫组织化学法检测小鼠肌肉组织目的抗原的表达取小鼠大腿

9、注射位置的肌肉组织，投入10%中性福尔马林溶液中，固定12h；参照文献5制片及染色，显微镜观察并拍照。出现棕黄色物质判读为阳性表达。1.3.6免疫小鼠血清中IgG的测定按照文献5中的方法制备PV,抗原，调整抗原的质量浓度为0.5/zg/，按100/孔加入96孔板内，4C过夜，洗涤封闭后按100小/孔加入1:100稀释的待检血清，温育1.5h,PBS洗3次，按100/孔加入稀释度为1:10000的HRP标记的羊抗鼠IgG,37C温育1h,PBS洗3次后显色，终止反应后用BIO-RAD860酶标仪测OD响的A值。1.3.7外周血清中IFN-y的检测免疫小鼠30d后取两组小鼠血测定外周血清中IFN-

10、y的水平，检测试剂盒购于上海森雄科技实业有限公司。1.3.8数据统计利用统计学软件SPASS13.0进行单因素方差检验DNA疫苗免疫组与对照组之间的差异，P<0.05为具有统计学意义。L3.9小鼠免疫保护试验取免疫30d后的试验组及对照组小鼠各3只，将经复壮的TWN3菌悬液稀释配制成8.1X107cfu/ml,分别腹腔注射小鼠，每只0.3ml,观察1周记录小鼠死亡情况，对死亡小鼠进行解剖观察及病原菌分离。2结果2.1普通变形杆菌TWN3株保护性抗原基因片段PV,的筛选普通变形杆菌TWN3株总DNA经过限制性内切醵EcoRI消化，克隆到经EcoRI酶消化CIAP去磷酸化的PUC18载体，转

11、化感受态细胞大肠杆菌BL21,选择具有外源DNA片段的克隆，当克隆数达到3.6XIO'个重组子时，DNA文库构建成功。利用免疫印迹筛抗原基因，选取在硝酸纤维膜上经多次夏筛始终显示出深紫色斑的克隆（图1）,得到阳性克隆子。挑取对应菌落提质粒酶切验证（图2）,插入片段为PV,。序列测定如下（775bp）。1GAATTCAGCmTrTAArArAAmATrCTrGCrGTGATrArTAAATTrCIA53TrTTTACCAAAATGGTACTTATTAAATTACTGAGATrTAAGCAAAITTAKrC105ATTACCATACCAACCAGTAATAATATAATTCCACCCCAT

12、CCTTTATXrCAATC158AAGTGGTGCATnGGGTrAATGTCGTTGGCTGGTATTTAATGAGAACGTOA209CAAGCGCCTCTCACGTTGCTAAGTTGGATTGCGACGTCTAArCTGAGCAA260CGAATGCACAAGATTTAGAGTACCAGAGCCCTGTGATGCTGTCACGGGGC310TTTGTTACATCTGGAGCTTGGTAAACCTCATAAArTCAATTCXjCAACGCTCG362CCGCAAGGCGTGAACTTGnTCACGTCGAGGAAGCGGAAnTCTCGAAAG412CCTTATACTGTCTCCGT

13、rCACACXrGArCGGAGGGTGTeTCTATGTCTCAAr464TAnTCGnTGGCATCGCCAGAAGArTACGAArACATCGAAGAArrAAAnT516ATGGGAATTGTCATTTGArAAGCGACCGGTrCAAGGGGTTCGrrGTGAAGA567TCCGGTGArCGGGGCAGAAAAATArAArCAAGGGCGTGAAAAATTTAAGGCfilSGTTAGCGTCACGGCATAAAAAACACTGGAAACCGAACGGATTGACCTTTTC669GGAGTTGATCCGCTG<jGCAArAGAATGCGGAACrCCAGAACAA

14、rGTCAGCTTZOTGTTTTAGCGTTATACCATTGCACAAACGArGArGATTXrCACGCGATGGGA772ATTCAB图1阳性克Pt免疫印避A：阳性对照(TWN3菌体蛋白)；B：阴性对照(BL21/pUC18)»4,阳性克(pUC18-PV4).bp1500010000750050002500bp15000100007500500025001000250图2阳性克隆pUC18-PV,EcoRI切结果1.MarkerDI»2.pUC】8斡切结果3.pUC18-PV,酶切结果.2.2DNA疫苗的构建和鉴定pcDMA、载体与PV,的连接产物转化感受态JM

15、109,挑取转化菌落提取质粒,EcoRI单酶切验证，有插入片段，大小与PV,致，得到重组质粒pcDNA3-PV<(图3),同时测序结果与2.1中的结果-致，DNA疫苗构建成功。DNA疫苗的真核表达情况通过小鼠试验获得。2.3疫苗的大量制备及免疫动物DNA疫苗和空载体的OD2g/OD28。皿约为1.8,质量浓度为1.0mg/ml,利用0.85%NaCl调整终质量浓度至500网/ml,每只小鼠免疫100网,分别在两侧大腿肌肉上各免疫50Mge免疫后小鼠未出现异常现象，正常进食。123图3疫苗pcDNA3-PVEcoRI醺切结果1.MarkerDL15000.2.pcDNAi的切结果;3.pc

16、DNA3-PV4W切结果.见，免疫peDNA-PV.的试验组血清中的含最较pcDNA3对照组高，利用SPSS13.0统计学软件进行单因素方差分析,pcDNA3-PV4组血清中的IFN-y与pcDNA3组存在显著差异(PV0.05)。2.4免疫组化结果试验中的兔血清为TWN3菌体蛋白的抗血清，由实验室制备保存于冰箱一80C备用，稀释倍数为1:200,结果见图4、图5,免疫pcDNA3-PV,的试验组肌浆中表达的抗原呈现棕黄色至黄色，免疫pcDNA3的对照组细胞核为蓝色，未检测到抗原的产生。图4免«peDNA：,的对照组小鼠肌细胞中无PV,抗原产生(200X)图5免疫peDNAj-PVS

17、苗的小鼠肌细胞胞浆中有PV,抗原产生(箭头所指处X200X)2.5免疫小鼠血清中特异性抗体IgG的测定用于ELISA检测的小鼠血清稀释倍数1:100,检测结果见图6,利用SPSS13.0统计学软件进行单因素方差分析，试验组与对照组存在显著性差异(P<o.05).2.6外周血中IFN-y的检测外周血中IFN-y的检测结果见表1。由表1可衰1免疫30d后2组外周血清中IFN-y的含(pgmL)(n=3)免疫时间/dpcDNAj-PV4fflpcDNA3ffl3018.16±0.5288.215±0.3512.7小鼠免疫保护试验免疫DNA疫苗的小鼠1只死亡，解剖未发现与大口

18、幼相似的症状。免疫空载体的对照组3只小鼠全部死亡，对刚死亡的小鼠进行解剖发现，小肠胀气且大多化脓性坏死，大肠和胃有出血现象，从死亡小鼠的肠、胃中分离到TWN3菌株。初步显示免疫DNA疫苗的小鼠获得对TWN3菌的免疫保护力。3讨论3.1构建DNA文库筛选病原菌相关抗原基因或片断核酸疫苗(Nucleicacidvaccine)是将含有编码某种抗原蛋白的外源基因或片断克隆到真核表达质粒载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生体液免液和细胞免疫应答，获得对致病菌的免疫能力。普通变形杆菌TWN3株由实验室首次从大口幼中分离得到，尚未见明确致病因子

19、报道，试验采用构建普通变形杆菌TWN3株DNA文库的方法，利用免疫印迹筛选广泛筛选相关抗原相基因或片断。从免疫印迹结果可以看见筛选到的PV,可以表达蛋白质，对该序列进行简单的开放阅读框分析，片段中有一约300bp的开放阅读椎(ORF),同时进行序列比对未发现同源性蛋白，提示PV,可能编码新的蛋白。因此试验直接利用PV,进行DNA疫苗构建。3.2利用小鼠做动物试验动物试验首先采用小鼠主要原因如下：检测DNA疫苗在小鼠中的真核表达情况，同时初步判断DNA疫苗的免疫效果；普通变形杆菌TWN3株对小鼠有较强的致病性，病症与鱼类一致；鱼类与哺乳动物具有相似的免疫作用因子，IrG、IFN-yJL-2w等免

20、疫因子参与免疫应答；小鼠作为动物模型研究免疫应答十分成熟，在鱼类尚无类似用于研究免疫反应的模式动物。若DNA疫苗表达强且对小鼠有一定免疫效果，则进行鱼体试验，若无效果，则重新构建DNA疫苗。这些结果将为鱼体试验提供参考依据，并为鱼用核酸疫苗的研究羹定基础。3.3DNA疫苗实际应用中需解决的问题当前规模化运用于鱼类养殖的DNA疫苗很少，据Lorenzen等口°】报道，2005年有2种鱼用DNA疫苗获得许可证。鱼用疫苗难以规模化的原因主要是由于鱼类个体小，种群数量大，DNA疫苗的注射法或基因枪法在操作上存在一定困难。同时鱼类主要病原表面抗原研究基础薄弱。而戴贤君等利用减毒沙门氏菌(Sal

21、monellatyphiniuri-作为疫苗载体，采用口服形式免疫草鱼(Cteno-pharyngodonidellus)9取得了一定的效果，但尚未形成产业化。今后的研究方向是对DNA疫苗的载体进行研究，使DNA疫苗能够以口服的形式接种，方便DNA疫苗的使用；改造重组疫苗，如构建复合疫苗，或加上强启动子等方法来增强疫苗的表达；改进免疫途径来增强疫苗效果；DNA疫苗的安全性问题等。这些问题的解决将给鱼用疫苗带来巨大的发展空间。参考文献：1 郝贵杰，沈锦玉.潘晓义.核酸疫苗的研究进展及其在鱼类免疫中的应用J.大连水产学院学报.2007,22(2) :142-148.2 曹海军，李永文.雷雨.等.大

22、口械致病菌的分离鉴定、系统发育分析及相关特性的研究口.微生物学报，2007,47(1):1-6.3 张涛.丁洁,张黎，等.普通变形杆菌TWN-3株基因组文库构建及免疫印迹筛选口.淡水渔业.2007.37(2)：12-15.4 萨姆布鲁克J拉塞尔DW.分子克隆实验指南M.3版.北京：科学出版社.2002,沈关心.周汝麟.现代免疫学实验技术M.武汉：湖北科学技术出版社，1998.5 曾政.王英,赵光宇.等.布氏杆菌PCDNA3.1-L7/L12核酸疫苗的构建及其免疫学评价J.免疫学杂志，2004,20(3):208-212.6 DonnellyJJ,UlmerJB,ShiverJW,etal.DN

23、AvaccinesJ.AnnRevImmunol*1997(15)：617-648.7 RajeshKS.PrameswaranV,IshaqVPA.ProtectiveefficiencyofDNAvaccinationinAsianseabass(Lorescalcarifer)againstVibrioanguiliarumJ.Fish&ShellfishImmunology.2007(23)：316-326.9潘雪霞，邵健忠.项黎新.等.鱼类几种新型免疫因子的研究进展J.水产学报.2005,29(2):263-269.10LorenzenN.LaratraSE.DNAvacci

24、nesforaquacul-turedfishJ.RevSciTech.2005(24)：201-203.11戴贤君.方维焕.减毒沙门氏菌为载体的草鱼口服生长抑素DNA疫苗的构建及其稳定性口.中国兽医学报.2005,25(4):356-358.DNAVaccineofBacteriumProteusvulgarisTWN3StrainWANGJuan尊，GUWen-bo1,FENGJun2,GUJi-rui1*2,WUJiang2,XUHeng1*2(1.KeyLaboratoryofBio-resourcesandEco-cnvironmcnt(MinistryofEducation).CollegeofLifeScience*SichuanUniversity,Chengdu610064.China；2.TongweiGroupCo.Ltd,Chengdu610081,China)Abstract:BacteriumProteusvulgarisTWN3strainwasisolatedfromtissueofdeadsouthernsheatfishSt-lurusmeridionalisinwhichtheDNAlibrarywasconstru