液相色谱法测定脑膜炎球菌结合物原液中残余二甲亚砜.docx

1、论著液相色谱法测定脑膜炎球菌结合物原液中残余二甲亚砚傅元欣，雒丽红，冯潇，马庆华，魏然(兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心，兰州730046)摘要：目的建立并验证脑膜炎球菌结合物原液中残余二甲亚砚的检测方法。方法采用液相色谱法，使用Kro.masilC18柱(250mmx4.6mm),25%甲醇溶液为流动相,二极管阵列检测器测定脑膜炎球菌结合物原液中残余二甲亚碉。结果二甲亚砚在l100m#L的范围内相关系数厂大于0.999,线性关系良好，平均回收率为94%114%、变异系数为0.46%0.89%,最小定量限为l.0mg/L,远低于药典规定。结论该方法简便易行,结果准确。关

2、键词:脑膜炎球萌结合物原液;二甲亚很;高效液相色谱中图分类号：0657.7+2文献标志码：A文章编号：1005-5673(2013)04-0031-06DeterminationoftheresidualcontentofDMSOinmeningococcalconjugatesbulkofA,C,YandW135byHPLCFUYuan-xin,LUOLi-hong,FENGXiao,MaQing-hua,WEIRan(hinzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,Lld.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineering

3、Research,Lanzhou730046,China)Abstract:ObjectiveToestablishamethodfordeterminationoftheresidualdimethylsulfoxide(DMSO)inmeningococcalconjugatesbulkofA,C,YandW135.MethodsHPLCwasusedinthistest.ThecontentofDMSOwasanalyzedwithKromasilC18column(250mmx4.6mm),themobilephasewas25%methanol,anddiodearraydetect

4、orwasusedasdetector.ResultsAgoodlinercorrelationwasobtainedovertherangeof1-100mg/L,r>0.999.TheaveragerecoveryofDMSOwas94%-114%andtheaverageCVwas0.46%-0.89%.ThemethodcanquantifytheDMSOwithaminimumamountof1.0mg/Lforthesensitivityatleast1()timeshigherthanthatofnoiseassay.Thisconcentrationwasmuchlowe

5、rthanthelimitconcentrationinpharmacopeia.ConclusionsThismethodwaseasilyoperativeandaccurateforprecisedetermination.Keywords:MeningococcalconjugatesbulkofA,C,YandW135;DMSO;HPLC二甲亚砌i(Dimethylsulfoxide,简称DMSO)是一*种既含有亲水亚砚基团又含两个疏水甲基的两性有机小分子。这种两性特征赋予其两种有价值的特性:既有水溶性乂可溶解大量的亲脂性化合物,这些特性使DMSO在生物化学领域中被广泛当作溶剂使用。

6、在四价脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗生产制造过程中,DMSO也作为溶剂使用，中华人民共和国药典)(2010年版)三部将其列为第三类溶剂限制使用，其使用限度为0.5%，即5000mg/L。考收稿日期：2013-04-11；修回日期：2013-(M-27作者简介:傅元欣(1984.)，女，医学生物学工程师，主要从事生物制品质量控制工作。虑到该类溶剂对人体的危害以及在终产品中残留的可能性,DMSO的检测也成为质控之一。现行药典中并没有针对制品中DMSO的检测方法，可资借鉴的有关DMSO残留量的测定方法有反滴定法、元素分析法、微库仑测硫法、气相色谱法等。因DMSO是极性物质，如果采用气相色谱法测定其含量,

7、进样器温度选择困难，且色谱柱污染严重。目前也有部分人采用液相色谱法检测a。反相色谱以非极性键合相为固定相，如C18。流动相通常以水为基础，加入多种有机溶剂与之混合。DMSO是一种亲脂有机溶剂，可采用反相液相色谱法进行分析。可根据DMS。在色谱柱上的特定保留时间对其进行定性及定量分析。试验使用高效液相色谱法，建立了脑膜炎球菌结合物原液中残留DMSO的检测方法，并进行了方法验证，获得较为满意的试验结果。1材料与方法1.1材料1.1.1仪器设备HP105。高效液相色谱仪，二级管阵列检测器，均购自美国惠普公司。KromasilCl8柱（250nimx4.6mm），瑞典Krornasil公司。Agile

8、nt化学工作站,Agilent公司。1.1.2试剂及试验材料DMSO,Sigma公司。甲醇，一级色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司。Milli-Q级超纯水（电阻率为18MQcm）,Mil.lipore公司。四价脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗A群、C群、Y群、W135群单价原液，兰州生物制品研究所有限责任公司第一研究室提供。1.2方法1.2.1样品制备标准品的配制：准确称取0.05gDMSO加水定容至50mL,超声振荡5min,即为1000mg/L对照品储备液;供试品配制：分别将A群、C群、Y群和W135群脑膜炎球菌结合物单价原液用3K的超滤离心管离心（8000r/min,30min），将离心后的

9、液体取出，待测。1.2.2色谱条件的确定检测波长的确定:对DMSO进行全波长扫描，根据吸收强度选择合适的检测波长；仪器试验参数的设置：采用KromasilC18柱（250mmx4.6mm），硅胶颗粒大小5呻，流动相为甲醇-水（25:75）混合溶液,流速为1.0mL/min,进样体积20pX,收集时间5min,柱温为常温。1.2.3检测方法的验证专属性试验:分别用水、A群、C群、Y群和W135群脑膜炎球菌结合物单价原液的离心液作为待测品，按色谱条件进行测定。再以20mg/L的DMSO工作液为待测品，按色谱条件进行测定;标准曲线的建立、线性范围的确定及线性验证:将1000mg/L的对照品储备液分别

10、稀释成质量浓度为1、5、10、20、50、80、100mg/L对照品工作液，按色谱条件依次进行测定，不同时间重复测定5次，建立标准工作曲线，计算相关系数;回收率试验:将DMSO对照品储备液分别用A群、C群、Y群和W135群脑膜炎球萌结合物单价原液（每个群的原液选择三批）配制成1、40、80mg/L三个质量浓度作为待测品（36个待测品），按确定色谱条件分别进行测定。同样操作重复5次，每次每个待测品均按确定色谱条件分别进行测定，计算回收率;重复性试验：将DMSO对照品储备液分别稀释成10.50.80mg/L三个质量浓度，每个质量浓度在确定的色谱条件下分别测定10次，计算变异系数;最小定量限度的测定

11、：在确定的色谱条件下测定递减量的DMSO,以满足信噪比S/N=10为前提，准确度和精密度都能达到要求时能够定量测定出DMSO的最低量为最小定量限。1.2.4单价脑膜炎球菌结合物原液样品测定按确定色谱条件对8批单价脑膜炎球菌结合物原液样品进行测定。2结果2.1色谱条件中检测波长的确定对DMSO进行全波长扫描，发现其最大吸收在205.6nm,其后吸收值迅速下降，仅在270nm处有很小的吸收。使用270nm的波长对DMSO进行检测，1mg/L的对照品未出峰，方法的灵敏度很低。使用205nm的检测波长，流动相中的甲醇虽然有吸收，但吸收值非常低，即使是1mg/LDMSO的吸收相对于甲醇的吸收也要高出很多

12、,对检测无影响，所以选择205nm的检测波长。2.2专属性试验DMSO对照品溶液在1.2.2中描述的色谱条件下的保留时间为2.697min,与DMSO相邻的负峰为水峰（图1A、B）。A群、C群、Y群和W135群脑膜炎球菌结合物单价原液离心液在DMSO出峰处均未出峰（图1C、I）、E、F）。由此可见,试验方法对脑膜炎球菌结合物原液中DMSO检测特异，专属性强。2.3标准曲线及线性验证试验取DMSO对照品溶液在1100mg/L范围内作标准曲线。不同时间重复测定5次的相关系数见表1。结果表明在11。0mg/L范围内DMSO的浓度x与其色谱面积y呈现良好的线性关系，相关系数r均大于0.999,方法的精

13、密度高，重复性好。2.4回收率试验2.4.1A群脑膜炎球菌结合物原液添加回收试验在A群脑膜炎球菌结合物离心液中分别添加低、中、高三个不同浓度的DMSO对照品溶液，回收率均在94%111%之间，回收率较好（表2）。2.4.2C群脑膜炎球菌结合物原液添加回收试验C群脑膜炎球菌结合物离心液中添加DMSO后,DMSO回收率在94%107%之间，回收率较好（表3）。KI*1/VIF<4/I(_-z(6544321(nvg通未举svos蛋4321SVE)迥果尝>32洗脱时间/minSVE)妥垩.5。1234.()5.().5o.5os2Q7.5.2.05050505052075211sVE)a

14、尝洗脱时间/minA：20mg/LDMSO对照品溶液；B纯水；CF分别为A、C、Y、W135群脑膜炎球菌结合物单价原液离心液。图1专属性试验色谱图Fig.1Thechromatographydiagramofspecifictest表1线性验证试验Tab.1Linearityvalidationtestp(DMSO)DMSO色谱峰峰面积（mAU*；s)(mg/L)12345113.3613.8714.6513.6713.45576.4980.1472.1776.6175.6610151.17151.20147.71148.02149.6120300.47292.74297.37304,5829

15、7.3350780.08794.28779.12786.27775.99801213.221266.601221.701212.721235.141001548.881562.931538.421541.111556.37r0.999790.999870.999930.999990.99993表2A群脑膜炎球菌结合物原液添加DMSO回收率试验Tab.2TherecoveryofDMSOinmeningococcalconjugatebulkofgroupA批号理论质量浓度实测质量浓度（mg/L）平均回收率(mg/L)J2345(%)11.071.141.021.111.071.08108.00

16、200804074039.7738.9739.4739.8239.4939.5098.768080.7979.9180.3180.7380.6980.49100.6111.111.181.071.061.121.11110.80200903024039.6039.6539.3039.6139.9939.6399.088079.0679.2579.3879.5379.4879.3499.1811.010.920.920.950.930.9594.60200905014040.1540.7240.2140.4740.7240.45101.148080.2379.9780.0180.0779.828

17、0.02100.03表3C群脑膜炎球菌结合物原液添加DMSO回收率试验Tab.3TherecoveryofDMSOinmeningococcalconjugatebulkofgroupC批号理论质量浓度_实测质量浓度（mg/L）平均回收率(mg/L)12345(%)11.081.111.021.091.061.07107.00201012044039.4339.2739.8439.6439.4539.5398.828079.4578.9480.1579.3380.3279.6499.5511.021.031.061.071.021.04104.00200902014039.5639.7640.

18、3339.6439.9939.8699.648080.4779.9679.1680.0780.3880.01100.0111.010.920.920.950.930.9594.60200812054040.1540.7240.2140.4840.7240.46101.148080.2279.9780.0180.0879.8280.02100.032.4.3Y群脑膜炎球菌结合物原液添加回收试验Y群脑膜炎球菌结合物离心液中DMSO的添加回收率在95%106%之间（表4）。2.4.4W135群脑膜炎球菌结合物原液添加回收试验W135群添加DMSO回收试验结果如表5所列，可见其回收率在98%114%之

19、间°表4Y群脑膜炎球菌结合物原液添加DMSO回收率试验Tab.4TherecoveryofDMSOinmeningococcalconjugatebulkofgroupY批号理论质量浓度实测质量浓度(m&/L)平均回收率(mg/L)12345(%)11.091.041.021.051.121.06106.40200912014038.1439.0938.6738.7939.9138.9297.308079.1677.2477.9177.3277.2177.7797.2111.031.081.071.051.021.05105.(X)200911014040.0739.6739

20、.8439.9239.8439.8799.678080.0680.1879.7679.8479.779.9199.8910.920.940.970.960.960.9595.00200912014040.2640.0340.4539.9740.4740.24100.598080.4780.6180.4779.5480.0780.23100.29表5W135群脑膜炎球菌结合物原液添加DMSO回收率试验Tab.5TherecoveryofDMSOinmeningococcalconjugatebulkofgroupW135批号理论质量浓度_(mg/L)实测质量浓度(mg/L)-平均回收率(%)12

21、34511.121.001.071.071.071.07106.60200909014039.7140.6740.2939.8239.9640.09100.238079.9479.5979.8380.7380.8180.18100.2311.141.121.181.121.111.13113.40200911024039.5139.1839.6739.8239.0139.4498.608079.9480.3780.3880.7980.1880.33100.4211.001.010.990.951.071.00100.40201004014040.0140.2739.539.6240.239.9

22、299.808079.9581.2279.4180.1779.6580.25100.312.5重复性试验10次试验，结果见表6。从结果中可知试验的重复分别选取W.5O.8Omg/L三个质量浓度各做性较好,CV值最大不超过1%。表6不同质量浓度DMSO重复性实验Tab.6Therepeatabletestwithdifferentmassconcentration理论质量浓度测定值同D3%(mg/L)123456789101010.1410.1810.2310.1810.1410.0510.029.959.9910.050.895049.8749.4550.5149.9249.4149.5249

23、.3249.5149.2749.850.768080.3579.8280.4379.9880.4980.6480.9380.8980.7480.750.462.6最小定量限比大于10(见表7),此时水峰的影响可忽略,并且准当DMSO的质量浓度为1mg/L时，系统的信噪确度和精密度都满足要求，则最小定量限为1mg/L。表7DMSO质量浓度为1mg/L时系统信噪比Tab.7ThesystemSNRwhenthemassconcentrationofDMSOwas1mg/L检测次数信噪比111.7214.6313.9412.9513.2616.5715.0815.6916.21014.32.78批单

24、价脑膜炎球菌结合物原液样品测定8批单价脑膜炎球菌结合物原液样品直接超滤离心，滤出液中DMSO的残余量均小于线性范围的最低点1mg/L,见表8。表8单价脑膜炎球菌结合物原液样品测定Tab.8ThedetectingofDMSOinmeningococcalconjugatebulkofA,C,YandW135样品批号DMSO残余量(mg/L)PSA-TT201103006<1PSA-TF201104007<1PSC-TT201104002<1PSC-TT201103001-2<1PSY-T1201101002<1PSY-TT201104004<1PSW-T12

25、01104003<1PSW-T1201104004<13讨论DMSO在中华人民共和国药典(2010年版)三部中归为第三类溶剂限制使用，因此对制品中DMSO残余的控制就尤为重要。DMS。作为两性有机小分子与水具有高度的混合性，因而使水负峰与DMSO的峰完全分离具有很大的困难。试验过程中通过改变流速和向流动相中加入三氟乙酸都不能提高水峰与DMS。的分离度，两个峰始终相邻。只有使用甲醇来配制DMSO对照品时可以将两者分开,但由于脑膜炎球菌结合物原液中不含甲醇，因而对于实际样品的检测没有意义，因此依旧使用超纯水来配制DMSO对照品。方法中水负峰虽与DMSO峰相邻很近但儿乎不影响DMSO的定量分析，并且脑膜炎球菌结合物原液经超滤离心去除大分子后对DMSO的出峰也没有影响，因而此方法可运用于脑膜炎球菌结合疫苗中残留DMSO的测定。对于其他制品中残余DMSO的质量控制，如果制品本身对DMSO