泰国输华斑节对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的检测与分析.docx

1、泰国输华斑节对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的检测与分析hi于力，刘莹，郑晓聪，王津津.贾鹏，何俊强，刘黄(深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东深圳518045)摘要：为研究进口斑节对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒(InfectiousHypodermalandHematopoieticNecrosisVirus,IHHNV)的风险，本文采用了世界动物卫生组织(OIE)2015版手册中推荐的PCR方法，对2015年从泰国输华的329批次斑节对虾进行了IHHNV检测分析。结果发现，其阳柱率高达36.8%,且主要是感染1型和2型，以及风险不明的未知型.因此.来自秦国的斑节对虾具有较高的

2、IHHNV传入风险.应加强针对1HHNV的进口监测，戒少其对我国对虾养殖的影响。关键词：传染牲皮下和造血器官坏死病毒：斑节时虾：未如&因型：风险中图分类号：S851.34文献标识码：A文章编号：1005-944X(2016)06-0083-04DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.06.024TestandAnalysisofinfectiousHypodermalandHematopoieticNecrosisVirusonPenaeusmonodonImportedfromThailandYuLi.LiuYing.ZhengXiaocong.WangJ

3、injin.JiaPeng.HeJunqiang.LiuHong(AnimalandPlantInspectionandQuarantineTechnologyCenterofShenzhenEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau.Shenzhen.Guangdong518045)Abstract:InordertostudytherisksofInfectiousHypodermalandHematopoieticNecrosisVirus(IHHNV)ofimportedPenaeusmonodon.PCRmethodsrecommendedbyOI

4、Emanual(2015)wereusedtotestIHHNVon329batchesofPenaeusmonodonimportedfromThailand.Theresultsshowedthatpositiveratewas36.8%,andmajorgenotypesweregenotype1.2andunknowntypewithunclearrisk.Therefore,theIHHNVriskofP.monodonimportedfromThailandishigh.SuggestionsofreinforcingthesurveillanceofIHHNVtocontrolt

5、hisdiseaseandlimitthenegativeefleetonshrimpaquacultureofChinawereputforward.Keywords:IHHNV:Penaeusmonodon:unknowngenotype:risks对虾传染性皮下和造血器官病是养殖对虾的更要疫病，口J引起极高的死亡率(>90%)或生&发育畸形对世界对虾养殖业具有严取影响。世界动物卫生组织(OIE)将其列入须通报疫病。其病原是传染性皮卜和造血器官病毒(IHHNV),其宿'上为斑p'对虾(Penaeusmonodon)、南美白对虾(P.vannamei)和南美蓝对

6、虾(P.stylirostris)等。IHHNV属于细小病旋科，是己知最小的对基金项目：国家魇检总局科技计划项目(20101K007)通讯作者：刘拉虾病毒。病毒粒子大小为20-22nm,基因组为单链DNA,长约3.9kb"该病谁至少有3个基因型，其中1型主要分布在美洲和东亚，2型主要分布在东南亚，这两种基因型均为感染型(5。3型又分为3A型和3B型，其中3A型主要分布在东非、印度和澳大利亚等地区，而3B型则主要分布在印度太*洋地区。3A型和3B取将部分基因样列倏入宿主对虾的基因组，但不具备感染性气本研究采用了2015版OIE手册推荐的PCR方法，对2015年从泰国输华的斑节对虾进行了

7、检测，同时进行了流行病学调查与风险分析。1材料与方法1.1样品与对照样品为2015年从泰国进口到中国的活斑肖对虾,共329批次，均无发育畸形等典型临床症状。取样部位为便和皮卜如织。阳性对照为本实验室保“的IHHNVRI性组织，阴性对照为健康的斑日对虾组织。1.2引物合成引物采用2015版OIE手册推荐的PCR引物,洋见&1，由生工生物匚程(上海)有限公讪合成。表1IHHNV检测引物引物扩增产物大小序列(5-3，)392F392R392bpGGG-CGA-ACC-AGA-ATC-ACT-17AT('-CGG-AGG-AAT-CTG-ATG-TG3O9F3()9hpTCC-AAC-

8、ACT-TAG-TCA-AAA-CCA-AHRT(iT-CTG-CTA-CGA-TCiA-TTA-TCC-AMG831Fl(iX3IR831bpTT(i-(i(i(i-AT(i-CAG-('AA-TAT<TAT-CC'A-CT(；-ATC-G(iA-CTDNA提取将采集的集组织匀浆后提取DNAo本实验用到的组织均使用QIAampDNAMiniQIAcubeKit(QIAGEN)进行DNA提取。1.3 PCR检测使用ExTaq(TAKARA)进行PCR检测，引物终浓度为400nM根据O1E乒册(2015版),先使用392F/R引物对所有样品进行检测。若有阳性，则使用309F

9、/R与MG831F/R引物进行分型。以上3对引物的PCR反应程序均为95C5min,35个循环(95C30s.55,C30s,72°CImin),72,C7min1.5电泳与测序PCR产物使用毛细管电泳仪QIAxccI(QIAGEN)来分析，阳性样品送华大基因进行测序,与NCBIBLAST后，相似度95%以上确定为阳性。2结果2015年从329批斑节对虾中,共检出IHHNV阳性121批，阳性率为36.8%。按照OIE手册(2015版).引物392F/R能检出IHHNV的所有堆因型，而引物309F/R能检出I型和2型，MG831F/R能检出3A和3B型。若392F/R引物阳性，而309

10、F/R和MG831F/R均为阴性,则无法判断其基因型,本文暂称为未知型(图I)。检测结果汇总如友2与图2所示.使用卡方检验,季度之间阳性率无显著差异(P>0.05)。IHHNV各基因型所占的百分比例如图3所示。图IIHHNV未知型电泳注:1-2.引的392F/R论洲挞果，可£392bp大小条带：3.引物392FR阴杜时.峨：4.引物392FR阳姓时恐tSW.引物3(州R检洲站黑.未见条帝：7.引物309F/R阴柱时熙；8.引物3()91R阳性对熙：9-10.引物MG831F/R检测拈果，表见务帝：II.引物MG831F/RH时熙:12.引物MG83IF/R阳，性时熙<22

11、015年泰国输华斑节对虾IHHNV检测结果季度第二度第三羊度了，叫r度样品总数7292-63102阳性总数26(36.1%)30(32.6%)24(38.1%)41<40.2%)I型/2型9(12.5%)II(12.0%)12(19.0%)25(24.5%)2015年第、二季度的IHHNVPII性率相对较低,第三、四季度相对较高。每个季度的基因型主要为未知型和1/2型，而3A/3B以及1/2和3A/3B型共存的所占比较很小。泰国2015年输华斑节对虾的IHHNV各基因型所占的百分比中，I型/2型所占比例最大,为47%:未知型占44%:3A/3B型占6%：1型/2型和3A/3B型占3%（图

12、3）。3A/3B型1型/2型和图3泰国输华斑节对虾HIHNV基因型分布3讨论本研究采用了OIE手册（2015版）推荐的PCR方法，对2015年从泰国输华的斑打对虾进行TIHHNV检测分析。结果表明.总体阳性率高达36.8%,说明IHHNV感染的斑节对虾未必会表现出临床症状，这与OIE手册所介绍的情况-致。阳性样品中也要是感染1型和2型，以及未知风险的未知型。仃研究发现，斑廿对虾对IHHNV感染具有较高的耐受性叫，这也与该实验结果相符,说明IHHNV对斑节对虾致死率低，使M成为携带与传播IHHNV的风险俱从季节而言,第_、:季度的IHHNV阳性率相对较低，而第1、四季度相对较高，但无显著差异，可

13、能是由偶然因素或波动所引起的。关于未知型，在OIE手册中未见相关描述，相关文献也未有提及。但有文献指出IHHNV的基因变异率较高'5，IL现行方法无法区分出所有的基因型|Ml因此未知型可能是IHHNV的突变型，或者是由于现行方法的局限未能区分出的基因型,所以对其感染性以及风险未知。因此对于IHHNV未知型的样品应该谨慎处理，同时也应对其进行深入研究。本研究还观察到4批1型/2型和3A/3B型共存的现象，这与Tang等3）观察到的现象致，说明即使确认J'作感染型IHHNV,也不能排除其含有感染型的可能。所以在实际检测工作中应同时使用309F/R和MG831F/R引物进行分型分析。

14、综上所述,来自泰国的斑节对虾具有较高的传入IIIIINV风险，目.未知风险的未知基因用占仃近一半的比例。即使斑节对虾本身对IHHNV耐受，但也可能将其传播给其他易感对虾，造成极高的死亡率。我国是对虾养殖大国.同时也从东南亚进II大揪对虾,因此应加强IHHNV的进口监测,以更好地防控该病，减少其对我国对虾养殖的影响。参考文献：(ILightnerDV.RedmanRM.BellTA.InfectioushypodermaIandhematopoieticnecrosis,anewlyrecognizedvirusdiseaseofpenaeidshrimpJ.JInvertebratePatho

15、l.1983.42(I)：62-70.2 Lightner【)V,RedmanRM.BellTA.etal.DetectionofIHIINvirusinPenaeusslylirostrisandP.vannameiimportedintoilawaiiJ.JWorldAquacultureSociety.1983.14(I/2/3/4)：212-225.3 ChayabunikulK.NashG.PratanpipatP.etal.Multiplepathogens(bundingrowth-retardedblacktigershrimpPenaeusmonodoncultivatedi

16、nThailandJ.DisAquat()rg.2004.60:89-96.4 BrayWA.LawrenceAL.Leung-irujilloJR.TheelTcclofsalinityongrowthandsurivalofPenaeusvannamei.withobservationsontheinteractionofIHHNvirusandsalinityJ.Aquaculture.1994.122:133-146.5 FauquetCM.MayoMA.ManiloffJ.etal.Virustaxonomy:classificationandnomenclatureofviruse

17、s,eighthreportoftheinternationalcommitteeontaxonomyofviruses(M).ElsevierAcademicPress.2005:1259.6 BonamiJR.TrumperB.MariJ.etal.PurificationandcharacterizationofIHHNvirusofpenacidshrimps|J.J(ienVirol,1990.71:2657-2664.7 NunanLM.PoulosBT.LightnerDV.Useofpolymerasechainreaction(PCR)forthedetectionofinf

18、ectioushypodermalandhematopoieticnecrosisvirus(IHHNV)inpenaeidshrimpfJ.MarBiotechnoL2000(2)：319-328.8 TangKFJ,LightnerDV.Lowsequencevariationamongisolatesofinfectioushypodermalandhematopoieticnecrosisvirus(IHHNV)originatingfromHawaiiandtheAmericas(J).DisAquatOrg,2002,49:93-97.|9TangKEJ.PoulosBT,Wang

19、J.etal.Geographicvariationsamonginfectioushypodermalandhematopoieticnecrosisvirus(IHHNV)isolatesandcharacteristicsoftheirinfection(J|.DisAquatOrg.2003.53:91-99.10 TangKFJ.LightnerDV.Infectioushypodermaland(下转第89页)侦查总队：你总队关于对“速生鸡”养殖过程中使用的违禁药品如何定性的请示收悉，经商最高人民检察院、最高人民法院、农业部，现就你总队请示事项答复如下:金刚烷胺、利巴韦林是目前禁止

20、经营和使用的药品，地塞米松为糖皮质激素，属激素类产品，临床用于马、牛、猪、羊等家畜和犬、猫等宠物的炎症性、过敏性疾病，根据兽药管理条例，禁止在饲料和动物饮水中添加激素类药品。如查实在生鸡养殖过程中添加金刚烷胺、利巴韦林或地塞米松，构成生产、销售有毒有害食品罪和生产、销售伪劣产品罪，请你总队加大案件侦办力度，尽快侦结此案，及时移送起诉，依法追究不法分子刑事责任。”2认为属于非禁用物质的依据2.1农业部第560号公告该公告废止的兽药地方标准主要有5类，其中第二类是金刚烷胺类等，主要理由是因为人用抗病毒药移植兽用，缺乏科学规范、安全有效实验数据，用于动物病毒性疫病不但给动物疫病控制带来不良后果，而且

21、影响国家动物疫病防控政策的实施。可见，金刚烷胺类等人用抗病毒药只是因为给动物疫病控制带来不良后果而没批准为兽药，而非因为影响动物性食品安全而禁止使用。而且关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知（农医发（2005）33号）第四条规定“列入农业部公告第560号序号2的金刚烷胺、金刚乙胺、阿昔洛韦、吗啪（双）M（病毒灵）、利巴韦林等及其盐、酯的单、复方制剂等兽药，需通过兽药注册相关程序经我部严格审查批准后，方可使用于其他动物病毒性疫病。”可见农业部并未完全将其视为禁用物质，尚存在着转为兽药使用的可能。2.2关于办理危害食品安全刑事案件适用法律若干问题的解释（法释（2013）12号）解释第二十条规定：

22、“下列物质应当认定为有毒、有害的非食品原料：（一）法律、法规禁止在食品生产经营活动中添加、使用的物质：（二）国务院有美部门公布的食品中可能违法添加的非食用物质名单保健食品中可能非法添加的物质名单上的物质：（三）国务院有关部门公告禁止使用的农药、兽药以及其他有毒、有害物质：（四）其他危害人体健康的物质。”按照此标准，金刚烷胺、金刚乙胺等，既不属于法律法规禁止的，也不属于食品中可能违法添加的非食用物质名单保健食品中可能非法添加的物质名单卜.的物质，更不属于公告禁止使用的兽药及其他有毒、有害物质，只属于通知、批复认定禁止使用的物质。3讨论综上所述，金刚烷胺、金刚乙胺、阿昔洛韦、吗啡（双）M（病毒灵）、利巴韦林等，属于禁用物质的规定不明确、不严谨，为执法工作带来困难。为严厉打击此类物质的非法生产、经营、使用，确保动物产品安全，建议农业部要以公告等方式公开明确。（责任编辑：白雅娟）(上接第85页)hematopoieticnecrosisvirus(IHHNV)inthegenomeoftheblacktigerprawnPenaeusmonodonfromAfricaandAustraliafJ,VirusRes,2006,118:185-191.11 FlegelTW,NielsenL.ThamavitV,etal.Presenceofmultiplevirusesinnon