猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究进展 (1).docx

1、猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究进展谷元兴，王猛，刘永生，张杰（中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室，农业部兽医公共卫生重点开放实验室，甘肃兰州730046）摘要：猪繁殖与呼吸障碍徐合征（PRRS）是一种危害养猪业的璃毒性传染疾病，具有很高的传染姓和致死率.目询还没有根除该病的有效方法，主要以预防为主.疫苗免疫在预防疾病的发生和流行中发挥了巨大作用，因而受到充分至视并迅速发展.名,者将对近年来PRRS疫苗包括常规疫苗（灭活疫苗、弱毒疫苗）和新型基因工程疫苗（DNA疫苗、亚单位疫苗、活我体疫苗）的研究进展作一综述.收稿日期：2009-12-30基

2、金项目：甘肃省科技重大专项（0801NKDA034）作者简介：谷元兴（1983-）,男，硕士，山东A南人，主要从事病毒分子生物学和免疫学研究.通讯作者：刘永生.关键词：指繁殖与呼吸综合征；预防；常规疫苗；新型疫苗猪的呼吸系统疾病、繁殖障碍性疾病、腹泻病是目前公认的制约我国养猪业发展的三大疾病，给我国养猪业造成了巨大经济损失。猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）俗称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种主要以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为临床特征，各日龄猪只均可感染的接触性传染病，同时也是日前导致

3、我国养猪业三大疾病的主要元凶之一。1987年在美国首次发现PRRS临床病例，随后几年时间该病便席卷了北美洲和欧洲大陆。1991年，荷兰Lelystad中央兽医研究所WensvoortG等利用肺泡巨噬细胞（PAMs）分离到病毒，并命名为Lelystad病毒（LV）,这是科学家首次分离到PRRSV。】。1996年，郭宝清等首次从猪流产胎儿中分离到PRRSV,证实猪繁殖与呼吸综合征也存在于我国2006年5月份至2007年底，我国暴发了变异美洲型高致病性蓝耳病，全国养猪业遭到重创，直接经济损失达到12亿元“F。根据国际动物卫生组织（OIE）的公布情况，目前世界上除澳大利亚、新西兰等极少数国家外，其他大

4、部分国家和地区都存在PRRS3J。虽然世界各国都对该病的致病机理及流行传播方式进行了多方面研究，但至今还未找到根除的有效方法。利用疫苗免疫不仅能够减少抗生素的滥用，降低药物残留，从而保证食品安全，而且能够降低养殖成本，使用也更为简捷。为此各国相关专家对PRRS疫苗做了大批的研究，力图有所突破，给养猪业带来福音。1常规疫苗PRRS灭活苗和PRRS弱毒苗是目前生产实践中应用较多的两种疫苗。虽然目前很多学者对这两种疫苗的使用存在着分歧，但灭活苗安全性好，弱毒苗保护力强的说法还是得到了大多数学者的认同。1.1PRRS灭活苗灭活苗是将致病性病原体大量培养后进行灭活处理，使其失去感染性而保留免疫原性制得的

5、疫苗。灭活疫苗是较早研制的疫苗，使用后主要刺激猪体产生体液免疫反应。因其是死苗，故最大的优点是安全、不散毒、便于储存和运输。Ba-yer公司于1997年首次推出了灭活疫苗PR-RomiSetM,目前我国已有20家企业被农业部批准生产PRRS灭活疫苗:CH-la株（哈尔滨维科生物技术开发公司）和NVDC-JXA1株（浙江易邦生物技术有限公司等19家），主要用于PRRS阴性猪场的免疫。国内学者郭宝清等曾利用国内分离的PRRSVCH-la毒株，经甲醛灭活后制成PRRS油乳剂灭活疫苗.随后的免疫效力试验和免疫攻毒试验表明其具有一定的免疫效果，在首免后5d就可检测到病毒特异性抗体，20d左右抗体就可达到

6、高峰，并可持续6个月左右，具有较长的免疫保持期。PlanaDuran"曾报道应用西班牙毒株研制成一种油佐剂灭活疫苗，用于保护后备母猪取得了良好的效果；加拿大Ro-gan的研究表明：用PRRS灭活苗免疫猪后，可以刺激猪产生针对ORF5、ORF6、ORF7所编码的蛋白的抗体，而且可以减少猪病毒血症的发生。但Nielsen等应用此种疫苗免疫公猪却未取得明显的保护效果，灭活苗抗原成分不高以及灭活过程中主要抗原决定簇的丢失而使抗原性减弱，接种后产生的免疫应答很弱甚至检测不到特异性抗体反应，不能产生足够的免疫保护力。Nilubol等报道灭活疫苗免疫后攻毒不能保护仔猪对PRRS病毒的感染，病毒感染

7、后病毒血症的持续时间和病毒的滴度与非免疫组无显著差别。美国学者HJooC123曾在经过PRRS灭活疫苗免疫过2次的母猪群中，随机挑选2头妊娠100d和6头妊娠80-90d的母猪，采用ORF5核昔酸序列同源性为82.1%84.4%的PRRS异源毒进行攻毒试验，结果有7头流产，共产死胎63只、活仔14只。可见PRRS灭活苗不能够适应PRRSV有很强的变异性特点，对PRRS异源株免疫效果不理想。而且存在着免疫剂量大、免疫次数多和免疫产生期较长等缺点，因此单纯利用PRRS灭活苗来预防PRRS的发生及流行是远远不够的。1.2PRRS弱毒苗PRRS弱毒疫苗是将PRRS病毒株接种易感细胞后经多次传代培养，使

8、其毒力减弱至不具有致病性但能引起机体高度的免疫反应，产生大量相应的抗体，从而对机体起到保护作用的一种常规疫苗。自从BoehringerIngelheim公司于1995年首次推出商品化减毒疫苗RespPRRS/Repro®以来，PRRS弱毒苗以其免疫保护期长、保护率高、免疫剂量小等优点受到不少专家学者和养殖业主的亲睐。该疫苗也从开始只被允许用于318周龄猪的预防接种，发展到繁殖猪群的预防接种，并且针对不同年龄段猪群对该种疫苗的应用正在紧锣密鼓的研究之中。目前我国自主研发的CH-1R株、R98株JXA1-R株等PRRS活疫苗也纷纷面市购。胡守萍等U"分别采用(PRRSV)CH-

9、IR致弱毒疫苗株和变异毒株灭活疫苗免疫接种40-45日龄仔猪，4周后用高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)HuN-4变异株强毒攻毒，攻毒21d后剖检，结果显示变异毒株灭活疫苗免疫攻毒后导致的病理变化和病毒抗原分布程度均明显高于CH-1R弱毒疫苗免疫组。免疫病理学研究结果表明CH-1R弱毒疫苗对HU-4株强毒免疫保护效果好于变异毒株灭活疫苗。KritasSKL，5J等人在一个流行PRRS的猪场，应用英特威生产的弱毒疫苗(PorcilisPRRSVaccine)后，免疫组猪的产仔率(89%)显著高对照组(78%),而且每窝产活仔数及断奶仔猪存活数增加，返情率下降。然而对于应用PRRS

10、弱毒苗而引起的负面作用的报道也不少。有学者在商品化减毒活疫苗株IngelvacHPRRSMLV使用过的猪场分离到1株PRRSV,经测序表明，该毒株来源于疫苗株，但出现了疫苗株所不具有的致病性，并引起免疫猪出现肺部病变，揭示了使用PRRS的潜在危险性I”】。丹麦的Mortensen等口试验证明，用PRRS弱毒苗接种母猪后，会对母猪的繁殖性能造成不利影响，甚至可通过子宫感染仔猪。另有一些研究表明，弱毒疫苗毒株可以从免疫母猪传播给未免疫猪，导致后者出现繁殖障碍；弱毒疫苗毒株还存在毒力返强的危险W-购。因此prrs弱毒苗还是一把双刃剑，其散毒和每力返强的可能性成为最大的安全隐患，不建议PRRS阴性猪场

11、使用该疫苗，在某些国家甚至禁止使用。2新型基因工程疫苗鉴于灭活苗和弱毒苗各自的特点，要想很好的控制PRRS的发生和流行，开发新型PRRS抗原替代品迫在眉睫。蓬勃发展的分子生物学技术和PRRSV基因组的全序列测定以及病毒基因及其编码蛋白的结构和功能的研究，为新型基因疫苗的研发奠定了基础。一些能够编码具有诱导产生中和抗体蛋白的基因如ORF5.ORF6相继被确认，使基因工程苗的研制展现出广阔的前景。目前对PRRS基因工程疫苗研究比较多的有DNA疫苗、亚单位疫苗和活载体疫苗，此类疫苗的研制已经成为当今的主流并取得了可喜的进展。2.1DNA疫苗DNA疫苗又称核酸疫苗，是利用分子生物学技术将能够编码病毒保

12、护性抗原的基因导入宿主细胞内，宿主细胞会利用自身的转录系统合成保护性抗原，从而诱导产生中和抗体达到抵抗外来病毒的目的。DNA疫苗具有成份单一，生产工艺简单，免疫剂堂小，安全性相对较高等优点，并且可人为的进行修饰，同时诱导体液免疫和细胞免疫。其中较为典型的是对GP5的研究。GP5是由ORF5编码的，含有PRRSV主要的B细胞表位，能诱导机体产生特异性中和抗体。Kwang等网制备了分别表达PRRSV的ORF4、ORF5、0RF6及ORF74种结构蛋白的DNA疫苗并用于动物试验，结果86%的猪产生了明显的细胞免疫反应。通过ELISA、中和试验及Western-blot检测发现71%的猪产生了病毒特异

13、性抗体，对照组没有产生针对PRRSV的免疫反应，试验表明该DNA疫苗可诱导体液免疫和细胞免疫的产生。SuiHui等将PRRSV的ORF5基因克隆至真核表达裁体pIRESlneo的CMV启动子下游，然后用猪2型圆环病毒（PCV2）的ORF2基因替换pIRESlne。中的ne。基因，成功构建了重组表达质粒plRES-ORF2-ORF5。免疫小鼠后发现其脾T淋巴细胞亚群数髭显著高于灭活疫苗免疫组，说明所构建的二联苗能够诱导小鼠产生较好的体液免疫反应和细胞免疫反应。Hou等用含编码ORF5的质粒进行DNA免疫，可使接种猪产生抗ORF5的特异性中和抗体，接种猪没有出现强毒攻击造成的全身性病毒血症和肺部病

14、变，并且间质性肺炎和支气管肺泡炎明显减轻。DNA疫苗作为一种新型疫苗展现出了很好的应用前景，但其免疫效果的确切性，个体差异性对免疫效果的影响以及是否受母源抗体的影响，外源基因导人带来的不良后果如免疫耐受、免疫抑制等问题还需进一步研究。总体看来DNA疫苗的研究还正处于实验室研究阶段，在真正投入生产实践之前，还要在相应的临床动物模型中进行细致的研究，积累大量的实验数据。2.2亚单位疫苗利用化学分解或蛋白质水解的方法，提取细菌、病毒的特殊匮白质结构，筛选出具有免疫活性的片段制成的疫苗即为亚单位疫苗。直接从病原中提取病毒蛋白作为亚单位疫苗的生产成本较高，因此各国专家正试图利用基因重组技术研制PRRS亚

15、单位疫苗，即将含有PRRV保护性抗原基因的片段导入受体细胞，高效表达后提取产物，加入佐剂而制成。该种疫苗仅包含几种主要抗原决定簇，所以能避免许多无关抗原诱发抗体，从而减少疫苗的副反应。Pirzadeh等网用带PRRSV-ORF5基因的质粒DNA接种猪，猪体内能诱导产生抗GP5的中和抗体，并引起细胞免疫反应，阻止病毒血症的发展，可见ORF5在猪体内得到表达并引起了免疫反应。Duran等羽将PRRSV西班牙株Olot/91的ORF2-7分别插入到重组的杆状病毒的多角体蛋白启动子下游，应用sf9细胞进行表达，结果得到了ORF3、ORF5和ORF7基因表达生成三种的产物，分别加入油佐剂制成只含一种产物

16、及含三种产物的四种疫苗，通过肌肉注射免疫怀孕2030d的母猪，21d后加强免疫。在配种后70-90d用病毒滴度为106.1TCID50/mlPRRSV对妊娠母猪进行攻毒，每头5ml。结果发现ORF3和ORF5的表达产物能提供一定的免疫保护，保护率分别为68.4%和50%,并能阻止病毒复制。用ORF7表达产物免疫的母猪产生了强烈的IPMA抗体应答，但不能使所产仔猪得到保护，甚至干扰了其他产物的保护作用。该试验结果提醒人们ORF3和ORF5单独或者联合的表达产物可以作为研制PRRS疫苗的良好抗原。另有有专家用牛结核分枝杆菌表达了截短前30个碱基的PRRSVORF5基因和全长的ORF6基因，利用表达

17、产物制成疫苗免疫猪，30d后用Western-blot.ELISA等方法可以检测到针对PRRSV的特异性抗体，免疫60d后可以检测到有3/4的猪产生了中和抗体，而且攻毒后病毒血症持续期明显缩短皈。目前亚单位疫苗的不足之处主要表现在免疫原性相对较低，对佐剂的依赖性较大,这就需要在研制此类疫苗时除了要寻找免疫活性较高的特定抗原和高效的表达系统外，还必须开发出合适的佐剂，例如利用免疫系统中固有的细胞因子（11,一2、IL-12JL-18）.补体分子及裂解物等作为免疫佐剂来提高其免疫效果已经成为该领域的研究热点。2.3活载体疫苗用基因工程的方法对某些细菌和病毒进行改造，使之失去致病性并且具有充当病原微

18、生物活载体的功能，即将致病微生物的免疫相关基因整合到充当活载体的病毒或细菌基因组中，然后将其接种到动物体内，从而刺激动物机体产生相应的抗体。基于这种思想，对于PRRS活载体疫苗的研究也变得非常活跃。目前运用比较多的载体微生物主要有传染性胃肠炎病毒、腺病毒、痘病毒、大肠杆菌、沙门氏菌等，在PRRS活载体疫苗研究中也不例外。Alonso等顽首次以传染性胃肠炎病毒（TGEV）活病毒为载体制备PRRSV活病毒载体疫苗，利用TGEV辅助表达系统，构建表达Gp5的重组TGEV,采用滴鼻、口服和胃肠道三种途径联合免疫7d龄仔猪，共免疫三次（间隔7d）,末次免疫7d后采血，通过ELISA可检测到很高的GP5特

19、异性抗体。ShenGuoshun等构建了能表达PRRSVORF5ORF3和IL-18-ORF5-ORF3重组鸡痘病毒活载体，对猪初免后21d加强免疫，60d后进行攻毒。结果表明，该重组病毒能有效刺激猪外周血中T淋巴细胞的增殖和一干扰素的产生，经过ELISA检测和病毒中和试验都可以检测到针对PRRSV的特异性抗体。试验组猪的体温、病毒血症及支气管淋巴结中的病毒员显著低于对照组，表明该重组疫苗对PRRSV有一定的免疫保护作用。由于该疫苗能主动感染宿主细胞，因此可以减少疫苗用歧少，并且不需添加佐剂。在免疫效果方面该种疫苗兼有死疫苗和活疫苗的优点，可以同时启动机体细胞免疫和体液免疫。更具吸引力的是活载

20、体疫苗可以同时构成多价以至多联疫苗，达到一苗防多病的效果。3展望针对PRRS的病原特点与流行现状，尤其是我国集约化养殖不发达，防疫技术水平相对低下并且预防工作过分依赖于疫苗的情况下，加快新型疫苗的研究并且市场化已经刻不容缓。然而在研制疫苗时我们还遇到不少问题与挑战，如PRRSV的逃避宿主免疫的机理尚不清楚，PRRSV和其他病原的相互影响也不明了，PRRSV毒株易变异且变异方向难以预测等。因此进一步的研究要在针对PRRSV的基础研究方面下大力气，只有对PRRSV有一个科学准确的认识才能为疫苗的成功研制提供保障。在疫苗的临床试验方面不仅要针对PRRSV阴性猪，还要针对带其他病原如PPV.HCV等的

21、猪，这样才更具有现实意义。此外，对于疫苗安全性评价技术的研究，相关法规的配套，疫苗佐剂的开发等工作也应紧跟步伐。相信在不久的将来，高效安全、质美价廉的PRRS疫苗将被广泛的使用。参考文献：1 KcffabcrKK.ReproductiveFailureofUnknownE-tiologyJ.AmAssocSwinePractNcwsl.1989,(1) ：l-9.2 WensvoortG,TerpstraC*PolJM,etal.MysterySwineDiseaseintheNetherlands：theIsolationofLelystadVirusJ.TheVeterinaryQuart

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