化浊行血汤含药血清血管内皮保护作用及其体内给药时效差异的研究

1、化浊行血汤含药血清血管内皮保护作用及其体内给药时效差异的研究        【摘要】  目的观察化浊行血汤含药血清对缺氧内皮细胞的保护作用，以及其药理作用与动物灌胃给药的量-时效关系。方法以化浊行血汤不同给药方案、药后不同取血时间所得的药物血清为受试对象，培养血管内皮细胞，进行缺氧复氧实验，复氧同时给予不同化浊行血汤含药血清干预，采用MTT法观察不同含药血清对缺氧内皮细胞活性的影响。结果含药血清各组与模型组比较有显著差异(P<0.05)。给药后不同时间取血所获得的药物血清对缺氧内皮细胞活力的影响存在

2、一定差异，以2次/d灌胃连续3 d，并在末次灌胃90 min后取血所得药物血清药理效应最佳。结论化浊行血汤含药血清具有保护缺氧内皮细胞的作用，其血清药效与动物给药方法存在一定时效关系。 【关键词】  化浊行血汤； 内皮细胞； 血清药； MTT法中药复方进入体内后，不同剂量的药物其在体内的吸收、分布、代谢、排泄不同，血药浓度达峰时间和起效时间亦有较大差异。为研究中药复方化浊行血汤对内皮缺氧损伤的保护作用，本实验采用MTT法观察化浊行血汤含药血清对内皮细胞抗缺氧能力的影响，并据此筛选出合适的含药血清浓度用于后续内皮缺氧损伤的研究。1  材料与仪器1.1  对象雄性Sp

3、rague-dawley大鼠，体质量（250±20）g，购于山东中医药大学动物中心，符合国家二级实验动物标准；人脐静脉内皮细胞系（hUVECs，购自山东省医学院，自美国组织培养库ATTCCCRI1998引进）。1.2  试剂1640培养基（GIBCO公司产品）、胎牛血清（FBS，Hyclone公司产品）；四氮唑蓝(美国SIGMA)；二甲基亚砜(北京世纪银丰科技有限公司)。1.3  仪器 JJT-1300超净工作台（北京半导体设备一厂）；5%CO2恒温培养箱（Forma Scientific 公司）；倒置相差显微镜（美国AO Sientific Instrument

4、；酶标仪）；EL340I 全自动酶标仪（美国Biotok公司产品）。2  方法2.1  药物的配制和含药血清的制备化浊行血汤由荷叶、焦山楂、决明子、赤芍、酒大黄、路路通、虎杖、何首乌，制水蛭粉组成（全部药材来源于山东中医药大学附属），为水煎醇沉工艺制作浸膏，4贮存备用。    取SD大鼠按8.25 g/kg灌服化浊行血汤。中药A组大鼠按照每日灌胃两次连续3 d，中药B组大鼠按照灌胃1次/d，连续5 d，空白组灌服等量生理盐水，末次给药前禁食12 h，给药后30，60，90，150 min腹主动脉取血，分离血清并灭活、过滤除菌，置20保存备用。2

5、.2  内皮细胞体外缺血、缺氧模型的建立和实验分组选择生长良好的内皮细胞，以5×104/ml 密度接种于96孔板，培养24 h后，分为正常对照组、模型组及药物（缺氧）各剂量组进行缺血、缺氧造模及干预。 正常组：换1640培养基（1640 90%，正常大鼠血清10%），并始终在正常条件下培养。模型组：以2006年叶武等1报告的方法稍加改进。缺氧时先将缺氧罐（由干燥皿改装）提前10 min充入氮气（流速4.5 Lmin），以保证缺氧罐内气体的纯度，罐周边封凡士林密闭，然后置于37生化培养箱中，备用。将培养板中内皮细胞换缺氧无血清1640培养基（用前预先向培养基通入氮气3 min

6、）；将其放入缺氧罐内。缺氧6h后，将培养液换为含10正常大鼠血清的1640培养液，置于培养箱中（空气+5%CO2）继续培养18 h，然后进行检测。中药各剂量组：造模同模型组，缺氧6 h后，将培养液换成含10SD大鼠药物血清的1640培养液，置于培养箱中（空气+5% CO2）继续培养18 h，然后进行检测。2.3  四氮唑蓝(MTT)检测各组内皮细胞两次，各加入1640 100 l，MTT 15 l，继续置培养箱中孵育4 h。吸弃孔内液体，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）100 l，终止反应。振荡器振荡10 min，全自动酶标仪490 nm波长，空白孔调零，测定各孔吸光度（OD）值。2.

7、4  统计学处理使用SPSS10.0软件进行统计。组内差异采用t检验，组间差异采用多因素方差分析，F检验(Avon)。1         3  结果3.1  各组内皮细胞形态特征变化镜下观察正常组内皮细胞展开贴壁，形态无明显改变。体外模拟缺氧6 h后模型组内皮细胞回缩，间隙变大，变圆细胞增多，常规培养18 h后大量内皮细胞变圆并呈团漂浮，折光性增强。中剂量中药各组镜下观察缺氧并经含药血清干预后也可见细胞回缩，部分细胞变圆并漂浮；但各组仍见贴壁的内皮细胞数量明显多于模型组，漂浮变圆细胞明

8、显少于模型组。3.2  各组内皮细胞缺血缺氧后细胞活力的比较（MTT实验）结果见表1。表1  10化浊行血汤含药血清对缺氧内皮细胞MTT比色实验的影响（略）4  讨论4.1  化浊行血汤含药血清的对缺氧复氧内皮细胞的保护作用王新陆教授根据多年的临床经验，以“血浊”立论，创立清化血浊法中风，并据此组方化浊行血汤。化浊行血汤由荷叶、焦山楂、决明子、赤芍、制水蛭、酒军、路路通、虎杖、何首乌组成。动物实验研究表明，化浊行血汤能明显改善MCAO大鼠缺血再灌注后的神经功能损伤、减小缺血再灌注脑损伤的体积，该治疗作用与其对脑血管内皮细胞、神经细胞的保护作用有关。本实验

9、建立血管内皮细胞缺血再灌注模型，利用化浊行血汤含药血清进行干预，以MTT评价内皮细胞缺氧损伤变化。MTT在活细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶作用下还原成一种蓝紫色结晶并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与活细胞数量成正比。实验研究证明缺氧复氧后内皮细胞活力明显下降并伴有显著地形态学异常，而化浊行血汤含药血清能显著提高缺氧复氧后内皮细胞的活力且形态学改变较小。提示该方具有明显的血管内皮细胞保护作用。4.2  化浊行血汤含药血清药效与动物体内给药有一定的时效关系中药血清药研究表明，含药血清的时效主要与动物的给药时间和取血时间有关。由于不同中药复方成分

10、很大差别，给药后的峰值出现的时间亦有较大差别。血清中确切的药效成分并不清楚时，应利用药效为指标行“时效关系”研究，以评判最佳给药时间和取血时间。严格地说，应该根据药物半衰期给药，连续57个半衰期达到稳态血药浓度，但由于中药及其复方成分复杂，半衰期很难测定，我们按照化浊行血汤为半衰期12 h设定每日灌胃两次连续3 d给药方案A，按照化浊行血汤为半衰期12 h设定每日灌胃1次连续6 d给药方案B，结果表明两种方案获得含药血清无明显差别。如果对药物血清时效关系进行研究，应另当别论。    实验动物学研究表明，大鼠一般灌喂给药后12 h后血药浓度达到峰值，此时的血清为机体功能状态血清，最好能通过预实验来确定最佳血时间，我们在本研究中设立了灌喂后30，60，90，150 min 4个采血时间点。结果表明，化浊行血汤含药血清血管内皮保护作用与大鼠取血时间有一定的时效关系，给药后药效逐渐增强，灌喂后90 min药效最明显，150 mim时药效已有下降的趋势，提示灌喂后90 min所得含药血清药物浓度最高，具有最佳的药理效果。    总之，我们的研究表明，化浊行血汤含药血清对缺氧血管内皮细胞的具有明显保护作用，