利用原生质体融合技术选育高产菌株

1、利用原生质体融合技术选育高产菌株李小俊,孙海虹,赵宝华,边艳青(河北师范大学生命科学学院,河北石家庄050016摘要:以龟裂链霉菌(S terpomyces rimosus 98#和76#为出发菌株,分别用溶菌酶制得2个亲本的原生质体,其中76#采用15W 紫外灯下30cm 照射25min ,100%灭活,用PEG 诱导进行了原生质体的融合.通过比较菌落外观、颜色挑选融合子328株,结合前期代谢情况进一步筛选高单位的融合菌株8株,经反复传代考察融合子的稳定性后得到1株新菌株102#,其发酵单位比亲本提高了13.0%.关键词:原生质体融合;灭活;筛选中图分类号:Q 939.97文献标识码:A 文

2、章编号:100025854(20070120112204土霉素(terramycin 是属于四环类的一种广谱抗生素,以其抗菌谱广、抑菌效果好、毒副作用小、饲料利用率高等优点,在医疗、畜牧业和农业上有广泛的用途和广阔的市场前景.近年来,随着菌种选育及工艺优斜面培养基:麸皮,琼脂.母瓶培养基:淀粉30g ,黄豆饼粉3g ,CaCO 35g ,(N H 42SO 44g ,NaCl 5g ,玉米浆4g ,KH 2PO 40.15g ,水1L.发酵培养基:淀粉150g ,黄豆饼粉20g ,CaCO 314g ,(N H 42SO 414g ,NaCl 45g ,玉米浆4g ,KH 2PO 40.1g

3、,淀粉酶0.15g ,消沫剂0.1g ,水1L.将76#原生质体悬浮液5mL 置于直径9cm 的双碟中,震荡照射5min ,紫外灯为15W ,垂直照射距离30cm 4.收稿日期:20060911;修回日期:20061115作者简介:李小俊(1981,女,河北清苑人,硕士研究生,研究方向为应用微生物.第31卷/第1期/2007年1月河北师范大学学报/自然科学版/总糖和还原糖测定:斐林试剂法.氨基氮测定:甲醛法.生物量测定:取发酵液称重,1500r/min 离心10min ,倾去上清液称重,计算湿菌体的百分比.发酵单位测定:参照文献5的方法.2结果与讨论2.1G ly 质量浓度对原生质体形成和再生

4、的影响图1G ly 质量浓度对原生质体形成和再生的影响G ly 在细胞生长过程中能取代细胞壁肽聚糖中的D Ala 残基,干扰交联,引起细胞壁结构的不完整,有利于去除细胞壁并释放原生质体.文献6表明,放线菌G ly 以240g/L 为宜.笔者实验采用3个G ly 质量浓度进行对比.结果表明,G ly 为10g/L 时的原生质体形成量最大;G ly 为5g/L 时的原生质体的再生率最大,因此实验采用5g/L G ly (见图1.2.2灭活效果将紫外灭活的76#原生质体涂布在再生培养基上培养,37培养7d ,菌落数为0,灭活效果为100%.2.3原生质体融合效果对上述菌株进行稳定性考察,102#菌株

5、的传代结果见表2.表14天残氮和7天效价结果菌株4天残氮/%7天效价/%02-25#99.010602-51#90.211502-83#95.010802-102#90.211302-156#95.010602-208#98.011802-289#95.010702-296#96.010876#130.010098#100.086表2102#菌株传代稳定性传代效价/%94.33112.5代谢特性考察对102#菌株进行生理代谢考察,结果见图 2.图2102#菌株的代谢特性1以76#菌株的孢子颜色为筛选条件筛选得到328株菌株,以4天残氮水平、7天发酵单位为筛选条件初筛得到8株菌株.筛选得到的8株

6、菌株4天残氮明显低于76#,略低于98#菌株;7天的发酵单位明显高于98#菌株,而且高于76#菌株,表现出氨氮代谢和发酵水平均优于双亲本的特点.因此,所选8株菌株为融合子,融合率为2.43%,其中102#菌株氨氮代谢和发酵单位明显优于两亲本.2102#菌株生理代谢特点为糖代谢、氨氮代谢明显快于双亲本,因此生物量明显高于双亲本.发酵前期102#菌株的发酵单位和双亲本没有太大的差异,是因为前期的快速生长抑制了抗生素的产生;在发酵中后期,102#菌株的发酵单位明显高于双亲本.3102#菌株经传代6次,菌落颜色仍然保持灰色,4天的残氮水平仍然明显低于双亲本,由此证明102#菌株的融合基因发生了重组并能

7、稳定遗传.随着传代次数的增加,7天发酵单位有所降低,但通过自然选育,菌种可以恢复原有发酵水平.这是部分孢子发生突变退化的原因,经过纯化,仍能保持原有的优良性状.4与常规育种方法比较,原生质体融合使两亲本的遗传物质更加充分融合,得到的重组子遗传特性更稳定、突变幅度更大,在工业化生产中有较强的实用价值.参考文献:1边艳青,李保荣,赵宝华,等.耐磷酸盐土霉素菌株选育和发酵研究J .中国抗生素杂志,2003,28(8:4562458.2贺筱蓉,黄小倩.链霉菌原生质体的制备J .生物学通报,1998,33(1:40241.4113姚曙光,刘瑞华,刘金荣.应用原生质体融合法选育林可霉素高产菌株J .安徽医

8、药,2003,7(1:62265.4陈五岭,罗雯,姚胜利.氦氖激光对链霉菌原生质体种间融合频率的影响J .光子学报,1998,27(5:4122417.5谢梅冬,余莲,邓伟泉.应用紫外分光光度计测土霉素含量J .广西畜牧兽医,1994,10(3:829.6施巧琴,吴松刚.工业微生物育种学M .福州:福建科学技术出版社,1991.2332242.Selection of the Mutation Strain with High Productivityby Protoplast Fusion T echniqueL I Xiao 2jun ,SUN Hai 2hong ,ZHAO Bao 2h

9、ua ,B IAN Yan 2qing(College of Life Science ,Hebei Normal Universit y ,Hebei Shijiazhuang 050016,China Abstract :The protoplasts of strains 98#and 76#of S terpom yces ri mosus were obtained by dissolvent en 2zyme respectively.The protoplasts of strains 76#were treated with UV light for 15W ,30cm and

10、 25min ,the death rate reached 100%.The protoplasts fusion was induced by PEG.328strains were obtained by selecting the fusion 2stains with the character and color of colony ,then 8strains were obtained by further selecting with metabolism ,the stability of more progeny was tested and at last one st

11、rains 102#was obtained ,the ferment level was improved 13.0%than parent strains.K ey w ords :protoplast fusion ;kill ;select(责任编辑柴键(上接第111页4G OODRID GE L ,CHEN J ,GRIFFITHS M.The Use of a Fluorescent Bacteriophage Assay for Detection of Escherichia coliO157:H7in Inoculated Ground Beef and Raw Milk J

12、 .Int J Food Microbiol ,1999,47(122:43250.5杨水云,崔亚丽,赵文明,等.一种制备高效价噬菌合格悬液的有效方法J .西北大学学报,1999,29(1:15217.6WEBER 2DABROWSK A B ,ZIMECKI M ,MULCZYK M.E ffective Phage Therapy is Associated with Normalization of Cy 2tokine Production by Blood Cell Cultures J .Arch Immunol Ther Exp (Warsz ,2000,48(1:31237.7

13、鲁会军,韩文瑜.雷连成治疗性噬菌体制剂研究进展J .中国兽药杂志,2002,36(6:39241.Phage Isolates and Lysis of Chicken Escherichia coliSUN Hai 2hong 1,MA Tong 2suo 2,YU Shan 1,ZHAO Bao 2hua 1(1.College of Life Science ,Hebei Normal Universit y ,Hebei Shijiazhuang 050016,China ;2.College of Biology Science and Biotechnology ,Hebei Un

14、iversity of Economics and Trade ,Hebei Shijiazhuang 050061,China Abstract :The antimicrobial 2resistant strains of Escherichia coli separated from clinic is very wide.Experi 2ment shows that average resistant ratio of E.coli to eighteen kinds of antibacterial agents is nearly 80percent.Common antibacterial agents therapy effects are usually far from