六种细胞凋亡检测方法的比较

1、本课题受国家自然科学基金资助(编号39870296作者单位:610041成都,华西医科大学附属第一医院医学检验专业,检验科技术交流六种细胞凋亡检测方法的比较彭黎明细胞凋亡已成为生物医学领域的研究热点。随着研究的日益深入,细胞凋亡的检测技术日渐成熟和完善,如形态学检查、DNA降解分析和流式细胞分析(FC A等1。我以地塞米松(DEX诱导淋巴瘤Raji细胞凋亡,利用6种不同方法检测细胞凋亡,并比较其结果,对这些方法加以评价。一、材料与方法11材料:(1细胞系:Burkitt淋巴瘤细胞株(Raji,澳大利亚墨尔本大学医学院Austin医院血液科提供,常规培养于10%热灭活小牛血清的RP MI1640

2、液中。实验用细胞均处于指数生长期。(2主要试剂:DNA未端定量(TdT法和放射自显影法的试剂分别由Pharmacia和Bresatec公司提供;FC A 试剂购置于Bender Med System公司,原位缺口末端标记(T UNE L法试剂来自Boehring Mannheim公司;其它化学试剂由S igma公司提供。21方法:(1细胞凋亡的诱导培养2:5ml Raji细胞(1×107个/ml与110m ol/L DEX培养2、4、8和16小时后,分别收集细胞,作细胞凋亡的检测。对照组不加DEX培养16小时。(2DNA抽提和凝胶电泳3:Raji细胞的DNA抽提按标准的酚2氯仿2异戊

3、醇抽提法进行。通过测定DNA溶液在260nm和280nm的吸光度确定DNA的量与纯度。凝胶电泳时取约1g DNA样品,在T BE缓冲液,1%琼脂糖凝胶上, 510V/cm电泳3小时,溴化乙锭(E B染色,在紫外发光仪下观察并照相。(3透射电镜(E M观察:培养细胞离心,以P BS 液洗2次后,用215%的戊二醛于4冰箱固定30分钟,常规制作电镜标本,双铅染色后,置1200EX型透射电镜(J E O L 公司观察。(4TdT法和放射自显影法:采用已建立的TdT 法4和利用同一标记反应进行的放射自显影法5分析DNA 梯形带。(5T UNE L6:培养细胞离心以新鲜配制的4%多聚甲醛P BS液(pH

4、714室温下固定30分钟,然后用Boebringer Mannbeim公司提供的试剂盒进行检测。标记产物在光镜下显棕色。(6FC A7:培养细胞以011mm ol/L P BS液(pH714洗2次,悬溶于190l结合缓冲液中,调整细胞浓度为1×106个/ml。加10l异硫氰酸荧光素(FTIC标记的连接素(Annexin和10l的20mg/L的普匹碘氨(PI,混匀,避光室温孵育10分钟。用结合缓冲液洗1次后用C oulter E lite流式细胞仪(C oulter公司进行分析。二、结果11DEX诱导的Raji细胞凋亡:透射电镜与DNA梯形带分析是目前鉴定细胞凋亡最具特征性的指标1,8

5、。电镜观察结果显示,经DEX诱导8小时的Raji细胞有典型的凋亡细胞出现。其特征是细胞核体积缩小,染色质浓缩致密,并沿核膜分布形成新月体状,细胞膜微绒毛消失,但细胞浆内的各种细胞器基本正常(图1。未经DEX诱导的细胞8小时培养后仍未见典型的凋亡细胞出现。琼脂糖凝胶电泳和放射自显影分析结果(图2表明,经DEX诱导的Raji细胞DNA呈现典型的梯形带,但放射自显影较琼脂糖凝胶电泳至少敏感50倍以上,因在同样条件下检测DNA梯形带,前者仅需DNA5ng,而后者却至少需250ng。同时,T UNE L结果显示DEX诱导细胞与对照细胞相比,细胞核内有明显的标记产物出现。根据电镜与T UNE L的形态学识

6、别标准1,6,9,由2位有经验的观察者以双盲法分别记数500个细胞,结果显示凋亡细胞数随DEX诱导时间延长而增加(图2,表1 。图1DEX诱导组的Raji细胞,凋亡细胞(×2 000M:分子量标志,1:DNA250ng,2:DNA2250ng,3:DNA21250ng(左图,DNA2500ng、DNA250ng、DNA25ng(右图;4:对照组DNA 图2DEX诱导组琼脂糖凝胶电泳和放射自显影分析的结果21FC A 定量凋亡细胞:对1500020000细胞进行FC A定量分析并区分活细胞(连接素V 阴性/普匹碘氨阴性,凋亡细胞(连接素V 阳性/普匹碘氨阴性,继发性坏死细胞(连接素V

7、阳性/普匹碘氨阳性,机械性损伤细胞(连接素V 阴性/普匹碘氨阳性。FC A 结果显示,凋亡细胞数与DEX 孵育时间呈显著的正相关(r >0.95(图3,表1。 图3三种凋亡细胞方法检测结果的比较表1四种检测细胞凋亡方法结果比较(%时间组(h 电镜凋亡细胞T UNE L阳性细胞FCA 连接素2V 阳性细胞TdT 次/(m in g DNA 0(0.5(0.8( 2.039402(0.6( 2.3( 4.31809004( 2.3( 4.5( 6.52668008(7.5(11.2(9.846905016(16.7(18.9(13.270123631TdT 法定量DNA 降解末端:TdT 法

8、分析DEX 诱导Raji细胞凋亡的动力学试验结果表明,DNA 末端标记量与DEX 浓度大小和作用时间长短呈显著正相关(r >0.98,图4;经1.0m ol/L DEX 作用不同时间(2、4、8、16小时的Raji 细胞产生的DNA 末端标记量较对照组高约45、68、119和178倍,与其他方法相比,显示TdT 法具有高检测灵敏度(表1。 图4TdT 法定量DNA 末端标记量结果414种细胞凋亡方法的比较:以线性回归对4种细胞凋亡方法(电镜、T UNE L 、FC A 和TdT 法的结果分析表明,DEX 诱导的凋亡细胞数或DNA 降解末端标记量与DEX 作用时间具有显著的相关性(r &g

9、t;0.98。用电镜作为检测凋亡细胞的金标准1,10,与其他3种方法(T UNE L 、FC A 、TdT 比较,结果发现它们之间有显著相关性(r 0.98。把TdT 法与FC A 的结果比较发现,二者仍有良好的相关性(r =0.99。三、讨论通过对6种检测细胞凋亡的方法进行比较发现,既简单又特异的方法仍是经典的透射电镜形态学观察和凝胶电泳检测DNA 梯形带,但其缺乏检测的灵敏度,而且难以定量;应用末端标记结合放射自显影可使DNA 梯形带的分析较凝胶电泳检测的灵敏度提高至少50倍;4种定量细胞凋亡的方法(透射电镜、T UNE L 、FC A 、TdT 法的检测结果之间有较好的相关性。同时,FC

10、 A 快速、准确,适用于单个或培养细胞(如血液,骨髓的检测,而TdT 法的检测灵敏度很高,如与检测特异性强的方法结合,可使分析效果更佳。值得提出的是,依赖形态学的透射电镜或T UNE L 法定量凋亡细胞费时效率较低,重复性较差8,9。本文6种检测细胞凋亡的方法的检测特点和原理不尽相同。有4种方法是分析凋亡细胞核酸内切酶的激活引起的DNA 降解,它们分别是检测DNA 梯形带的凝胶电脉和放射自显影,标记细胞内降解DNA 产生的32OH 末端(T UNE L ,定量DNA 末端的标记量(TdT 法,但后两种方法的特异性不强是因其他形式的死亡细胞,如坏死细胞也可以引起T UNE L 和TdT 法的阳性

11、结果11。本文的FC A 阳性结果是基于凋亡细胞膜上磷脂对称性的改变,而使磷脂酰丝氨酸外露,进而与连接素V 特异结合,同时用PI 分析细胞膜的完整性以定量检测早期的凋亡细胞和晚期的坏死细胞数,结果客观、快速、重复性好。通过对6种检测细胞凋亡方法的比较研究发现,目前尚无完美的检测手段,众多研究方法各具特点,也有其局限性,故在研究细胞凋亡时,需结合既特异、灵敏,又能定量的多种检测手段,检测细胞在凋亡发生过程中的不同事件,提供更加准确、客观、全面的实验依据。志谢:本课题在澳大利亚墨尔本大学医学院Austin 医院血液科、病理科完成。参考文献19:3362338.2Hickman JA.Apoptos

12、is induced by anticancer drugs.Cancer M etastasis Rev ,1992,11:1212139.4彭黎明,M ike brisco ,Pam Sykes ,et al.用32PdCTP 标记断裂DNA 检测DNA 降解程度.中华核医学杂志,1997,17:62263.5Peng LM ,Liu JJ.A novel method for quantitative analysis of apoptosis.Lab Invest ,1997,77:5472555. 6G avrieli Y,Sherman Y,Ben 2Sass on S A.Ide

13、ntification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.J Cell Biol ,1992,19:4932501.7K oopman G,Reutelingsperger CP ,K uijten G A ,et al.Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells underg oing apoptosis.Blood ,1994,84:1

14、41521420.8Sg onc R ,W ick G.M ethods for the detection of apoptosis.Int Arch Allergy Immunol ,1994,105:327233219Harris on D J.C ounting apoptosis :why and how ?J Clin Pathol ,1996,49:M2452246.10Darzynkiewicz Z ,Juan G,Li X ,et al.Cytometry in cell necrobiology :analysis of apoptosis and accidental c

15、ell death (necrosis .Cytometry ,1997,27:1220.11Mundle S D ,Raza A.The tw o in situ techniques do not differentiatebetween apoptosis and necrosis but rather reveal distinct patterns of DNA fragmentation in apoptosis.Lab Invest ,1995,72:6112613.(收稿:1998204230修回:1998209216(本文编辑:霍临明论著摘要应用流式细胞术检测肺癌组织p16蛋

16、白表达丁翠敏徐金升孙志学左连富一、材料和方法39例取自河北医科大学附属第四医院手术切除的肺癌标本,其中非小细胞肺癌(NSC LC 31例,小细胞未分化癌(SC LC 8例。男:25例,女:14例,年龄:3365岁,吸烟者24例,肿瘤最大直径311cm ,淋巴结转移18例,31例NSC LC 中分化级24例,分化级7例,级:鳞癌镜下有典型的鳞状上皮的排列,癌细胞团中心有明显的角化珠,有明显的细胞间桥。腺癌镜下见癌细胞分化好,排列近似正常的腺体。级:鳞癌没有典型的鳞状上皮排列结构,但仍有清楚的片状与团块状结构。腺癌有各种不规则的腺腔,癌细胞分化程度较低,但一般都有腺癌的特征。级癌细胞分化极差,近似

17、未分化癌,鳞癌的癌细胞较小,但某些区域仍有多角形的鳞状上皮结构,腺癌有腺腔排列的特点,大部分癌细胞无腺癌的结构,排列弥漫。对其中29例进行5年随访。对照组取自肺癌远端的正常肺组织共12例。用北京中山生物技术有限公司的兔抗p16基因产物的多克隆抗体,流式细胞术检测方法,异硫氰酸荧光素,采用膜打孔法将染料引入细胞内,所用仪器为FACS420流式细胞仪。以荧光指数(FI 表示p16蛋白表达的相对含量,公式为:FI =瘤组织表达蛋白的平均荧光强度-对照组表达蛋白的平均荧光强度/正常肺组织蛋白表达的平均荧光强度。二、结果11NSC LC 、SC LC 中p16蛋白表达量减低:NSC LC 的p16蛋白的

18、FI 为0186±0112,SC LC 为0185±0106,与正常组织(1100±0109相比,差异均有显著性(P <0101。21p16蛋白表达量与病理分级有关:31例NSC LC 中分化级24例,FI 为0188±011,分化级7例,FI 为0178±0113,两者比较差异有显著性(P <0105。31p16蛋白表达与肺癌患者的性别、年龄、肿瘤大小、淋作者单位:050011石家庄,河北医科大学附属第四医院内科(丁翠敏、徐金升、孙志学;河北省肿瘤研究所(左连富巴结转移及临床分期均无关:男性25例,FI 为0185±01

19、11;女性14例,FI 0186±0111。年龄:3044岁6例,FI 0188±0107;4559岁26例,FI 0187±0111;6065岁7例,FI 0178±0113。不吸烟组15例,FI 0186±0109;吸烟组24例,FI 为0185±0112。淋巴结转移组18例,FI 0187±0191;无转移组21例,FI 为0186±0112。按肿瘤最大直径分为3cm 6例、36cm23例、>6cm 10例,FI 分别为0179±0105、0187±0112、0187±0109。按临床分期分为3