香辛方外敷对肺癌骨癌痛小鼠炎性介质和MCP-1的影响

1、香辛方外敷对肺癌骨癌痛小鼠炎性介质和MCP-1的影响何佩珊1，冯兴中1，姜敏1，潘国凤1，杨公博2，杨萌3，齐慧3 摘要目的：应用活体荧光成像肺癌骨转移癌模型，探讨香辛方外敷缓解骨转移癌痛的机制。方法：通过股骨内注射表达绿色荧光蛋白的人肺腺癌A549细胞建立肺癌骨转移癌模型，随机分为中药外敷组、扶他林组、模型组，每组10只。中药外敷组香辛方0.5 g/(kg·d) 外敷，造模后721天，1次/d；扶他林组0.1 g/(kg·d) 外涂，造模后721天，1次/d；模型组生理盐水0.5 mL/只外涂，1次/d；另设假手术组生理盐水0.5 mL/只外涂，1次/d。造模21 d后检

2、测小鼠血脊髓单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、白介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子（TNF）以及白介素-6（IL-6）的表达水平。结果：MCP-1表达模型组脊髓MCP-1表达水平(1.88±0.18) mg/L比假手术组(1.21±0.19) mg/L高，中药外敷组脊髓MCP-1表达水平(1.51±0.09) mg/L比模型组和扶他林组(1.67±0.11) mg/L降低（均P<0.05）。IL-1水平扶他林组(99.11±10.52) ng/L和模型组(104.46±11.07) ng/L IL-1水平比假手术组(75.69

3、±16.57) ng/L高，中药外敷组IL-1水平(85.97±11.88) ng/L比模型组和扶他林组低（均P<0.05）。TNF水平中药外敷组(447.91±44.67) ng/L、扶他林组(504.14±44.30) ng/L和模型组(534.84±48.89) ng/L TNF水平均比假手术组(357.69±35.96) ng/L升高，中药外敷组TNF水平比模型组和扶他林组低（均P<0.05）。IL-6水平各组小鼠IL-6水平差异无统计学意义（P>0.05）。结论：香辛方可能通过减少脊髓MCP-1蛋白的表达，

4、抑制中枢敏化；同时降低血IL-1和TNF水平。本方可能通过下调炎性介质表达，起到缓解骨转移癌痛的作用。关键词：芳香中药；骨转移癌痛；荧光成像；炎性介质；单核细胞趋化蛋白-1中图分类号：Q95-33；R734.2 文献标识码：A 文章编号：1007-6948(2019)03-0000-00doi：10.3969/j.issn.1007-6948.2019.03.000Effect of Xiangxin Prescription on Inflammatory Medium and MCP-1 in Mice with Bone Metastatic Cancer PainHE Pei-shan

5、, FENG Xing-zhong, JIANG Min, et al. Department of Traditional Chinese Medicine, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing (100038), ChinaAbstract: ObjectiveTo explore the mechanism of Xiangxin Prescription on relieving bone metastatic cancer pain using in vivo fluorescence imag

6、ing model of lung cancer with bone metastasis.MethodsLung cancer bone metastatic pain model was built by injecting human lung adenocarcinoma A549 cells expressing green fluorescent proteins into the femurs of 30 nude mice. After successful modeling, the mice were randomly divided into external appli

7、cation of Chinese herb group, Votalin group and model group, n=10. Sham operation group was also established with other 10 mice. The external application of Chinese herb group was externally given Xiangxin Prescription, 0.5 g/(kg·d); the Votalin group was locally applied with Votalin, with the

8、dose of 0.1 g/(kg·d); the model group and Sham operation group were embrocated with normal saline (0.5 mL). The external application in each group was kept for at least 6 h, once daily. For each group, monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1), interleukin-l (IL-l), tumour necrosis factor (TNF) an

9、d interleukin-6 (IL-6) were observed after the treatment.ResultsThe level of MCP-1 in model group (1.88±0.18) mg/L was higher than that in Sham operation group (1.21±0.19) mg/L (P<0.05). The level of MCP-1 in Chinese herb group (1.51±0.09) mg/L was less than that in model group (P&

10、lt;0.05). The levels of IL-1 in Votalin group (99.11±10.52) ng/L and model group (104.46±11.07) ng/L were higher than that in Sham operation group (75.69±16.57) ng/L (P<0.05). The level of IL-1 in Chinese herb group (85.97±11.88) ng/L was less than those in Votalin group and m

11、odel group (P<0.05). The level of TNF in Chinese herb group (447.91±44.67) ng/L was less than those in Votalin group (504.14±44.30) ng/L and model group (534.84±48.89) ng/L (P<0.05). The difference of IL-6 level in each group was not significant (P>0.05).ConclusionXiangxin Pr

12、escription could inhibit the expression of MCP-1 and reduce the levels of IL-1 and TNF, which could help to relieve the bone metastatic cancer pain.Key words: Aromatic Chinese herbs; bone metastatic cancer pain; fluorescence imaging; inflammatory medium; monocyte chemotactic protein-1癌性疼痛是晚期肿瘤最常见的症状

13、之一1，严重影响患者生活质量2。前期研究显示，芳香类中药外敷能降低骨转移癌痛小鼠机械性痛觉和热刺激痛觉3-4。本研究应用活体荧光成像肺癌骨转移癌痛模型，探讨芳香类中药外敷缓解骨转移癌痛的机制，为进一步研究其机理提供依据。1材料与方法1.1动物及细胞株SPF级雌性BALB/c-nu小鼠共40只，4周龄，体质量（18±2）g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，实验动物许可证号SCXK（京）2014-0004。转染绿色荧光蛋白的人肺腺癌A549细胞株，由安泰康生物技术（北京）有限公司提供。1.2药物香辛方以丁香、细辛（12）研磨成粉调匀，加入透皮吸收剂薄荷醇，由首都医科大学附属北京世纪

14、坛医院药剂室制作。扶他林乳膏剂1% 20 g，国药准字H19990291，北京诺华制药有限公司。1.3主要试剂及仪器75%乙醇（批号11151107），山东利尔康医疗科技股份有限公司；戊巴比妥钠（批号p3761），Sigma公司。注射器（批号329461），美国BD公司；FluorVivo-Model-100荧光成像仪，美国INDEC BioSystems公司；奥豪斯电子精密天平，美国OHAUS公司（型号CP323C）；医学图像采集系统，日本奥林巴斯株式会社；倒置显微镜，日本NIKON株式会社（型号MA100）。1.4小鼠骨转移癌痛活体荧光成像模型建立参考文献5方法，裸鼠麻醉(戊巴比妥钠麻醉)

15、后，仰卧，腹部朝上，用75%乙醇消毒股骨处皮肤。膝关节处与股骨垂直方向切一长0.30.5 cm的皮肤切口，小心暴露髌骨。先用一次性无菌1mL注射器针头在髌骨沿股骨长轴方向穿刺打孔，然后换上30 L注射器进入股骨骨髓腔，缓慢注入50 L表达绿色荧光蛋白的人肺腺癌A549细胞（1×106/mL）至股骨。注射完毕，用骨蜡封住针孔（图1）。无菌棉签蘸生理盐水清洗创口，皮肤缝合。建模后第3 d，以FluorVivo-Model-100荧光成像仪对所有小鼠进行全身成像（图2）。假手术组在股骨注入等体积的生理盐水，其余操作同上。造模第7 d，小鼠缩足反应增多，表明癌痛模型造模成功3。图1小鼠肺癌骨

16、转移癌痛造模照片 图2骨转移癌痛模型荧光显像图1.5分组与给药将造模成功的30只小鼠采用随机数字表法分为中药外敷组、扶他林组、模型组，每组10只；另设假手术组10只。中药外敷组给予香辛方0.5 g/(kg·d)，于术后721天相同时间（9：00）外敷。于手术切口旁开约0.2 cm局部贴敷，至少持续6 h，1次/d。扶他林组（标准对照组）给予扶他林局部用药0.1 g/(kg·d)，于相同时间进行局部涂抹，1次/d。模型组（一般对照组）和假手术组（无肿瘤负荷）给予涂擦生理盐水0.5 mL/只，1次/d。1.6观察指标及方法采集标本进行指标测定。造模21天后，麻醉处死小鼠，在冰上

17、剥离出小鼠腰椎（L3L5）脊髓，迅速放入液氮中保存。严格按照酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa）检测实验小鼠血浆（或血清）白介素-l（interleukin l，IL-l）、白介素-6（interleukin 6，IL-6）、肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor , TNF）及脊髓组织单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）的含量。1.7统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资采用均数±标准差（）表示，多组间的比较采用单因素方差分析

18、，后采用SNK进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1腰椎脊髓MCP-1的表达经SNK法多重比较显示，各组两两比较差异均具有统计学意义（P<0.05）。模型组脊髓MCP-1表达比假手术组升高（P<0.01），提示骨癌痛小鼠出现了痛觉中枢敏化。中药外敷组脊髓MCP-1的表达比模型组和扶他林组降低（P<0.01）。见表1 。表1各组小鼠腰椎脊髓MCP-1的表达比较 组别例数（n）MCP-1（mg/L）假手术组101.21±0.19模型组101.88±0.18a扶他林组101.67±0.11中药外敷组101.51±0.0

19、9bc注：a 与假手术组比较， P<0.01；b与模型组比较，P<0.01；c与扶他林组比较，P<0.05。2.2血IL-1水平经SNK法多重比较显示，IL-1水平扶他林组和模型组差异无统计学意义，中药外敷组和假手术组差异无统计学意义；其余两两比较，差异具有统计学意义。扶他林组和模型组IL-1水平比假手术组高（P<0.05）。中药外敷组IL-1水平比模型组和扶他林低（P<0.05）。见表2。表2各组小鼠血IL-1水平比较 组别例数（n）IL-1（ng/L）假手术组1075.69±16.57模型组10104.46±11.07a扶他林组1099.1

20、1±10.52a中药外敷组1085.97±11.88bc注：a与假手术组比较，P<0.01；b与模型组比较，P<0.01；c与扶他林组比较，P<0.052.3血TNF水平经SNK法多重比较显示，TNF水平扶他林组和模型组之间差异无统计学意义，其他两两比较，差异均具有统计学意义。中药外敷组、扶他林组和模型组TNF水平均比假手术组高（P<0.05）。提示肺癌骨转移癌痛小鼠血TNF水平升高。中药外敷组TNF水平比模型组和扶他林组低（均P<0.05）。见表3。表3各组小鼠血TNFa水平比较 组别例数（n）TNF（ng/L）假手术组10357.69

21、77;35.96模型组10534.84±48.89a扶他林组10504.14±44.30a中药外敷组10447.91±44.67abc注：a与假手术组比较，P<0.01；b与模型组比较，P<0.05；c与扶他林组比较，P<0.012.4血IL-6水平经方差分析，各组小鼠IL-6水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。表4各组小鼠血IL-6水平比较 组别例数（n）IL-6（ng/L）假手术组10100.71±12.62模型组10115.14±17.63扶他林组10123.17±21.48中药外敷组10125

22、.12±24.79注：组间比较无显著差异，P0.053讨论骨转移癌痛成因复杂，造成骨质破坏、骨痛、病理性骨折、脊髓压迫、高钙血症等，是晚期骨转移患者最痛苦的症状之一。骨转移癌属中医文献中“骨瘤”、“骨蚀”、“骨疽”、“骨痹”等范畴，清代外科证治全书又有“贴骨瘤，贴骨而生，极疼痛”记载。目前中医治疗多以补肾、活血为主6。中药外治法为体表直接给药，药力直达病所，止痛迅速有效，且可避免药物内服带来的某些副作用。因此，中药外治骨癌痛更具优势。吴师机理瀹骈文云：“外治之理，即内治之理，外治之药，即内治之药，所异者法耳。医理药性无二，而法则神奇变化。”张景岳在景岳全书杂证谟积聚中云：“凡坚硬之积

23、，必在肠胃之外，募原之间，原非药力所能卒至。宜用阿魏膏、琥珀膏，或水红花膏、三圣膏之类，以攻其外。再用长桑君针法，以攻其内”。对于癌性疼痛的病因，首先表现为局部的占位，阻滞经络气血的实性疼痛，因实致痛。芳香类中药具有走窜定痛的作用，同时其挥发油能促进其他药物透皮吸收，因此在疾病外治中应用广泛。研究表明，骨癌所触发的初级感觉神经元的兴奋性变化，以及脊髓神经化学变化、细胞重塑是构成其行为痛过敏的物质基础。骨癌导致初级感觉神经元兴奋性异常增加的因素来自两个方面：一是破骨细胞的过度激活；二是肿瘤细胞分泌TNF、IL-1、内皮素-1等因子。另外肿瘤组织中有20%30%的巨噬细胞能产生TNF和IL-1等，

24、二者也均能兴奋初级传入神经元7-8。而且骨癌痛动物初级传入神经元受到敏化与骨质破坏程度、肿瘤生长相关。OPG/RANK/RANKL通路是调节破骨细胞的形成和生存的关键途径。在恶性肿瘤的早期阶段，患者骨髓中即可分离出播散肿瘤细胞（disseminated tumor cells，DTCs）9-10。DTCs可分泌IL-1、IL-6、MIP1a激活破骨细胞的生成，这些因子与前体破骨细胞表面的核因子B的受体激活剂（receptor activator of NF-B，RANK）相互作用可活化下游的许多细胞间的信号通路：NF-B（nuclear factor-kappa B）、JUN 激酶及CaN/N

25、FAT信号传导通路，这些信号途径的激活促进破骨细胞的生成、成熟和存活。除了促进新生的破骨细胞形成，DTCs还可与骨髓中其他细胞相互作用，加强已存在的破骨细胞中的溶骨性骨吸收作用。DTCs分泌的前列腺素（prostaglandins）、甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）、甲状旁腺激素相关蛋白（parathyroid hormonerelated peptide，PTHrP）、活化的维生素D、IL-6及TNF可上调成骨细胞及骨基质细胞表面的RANKL表达11。Miossec等12研究表明：普遍存在于骨髓中的T细胞也可分泌激活破骨作用的因子。DTCs分泌的IL-6、IL-

26、1及TGF-可诱导T细胞分化为Th17细胞，该细胞可通过分泌IL-17促进破骨作用并诱导成骨细胞表面RANKL的表达。本研究结果提示，肺癌骨转移癌痛小鼠可见血IL-1、TNF水平升高。本团队前期研究显示，芳香类中药外敷不仅促进药物透皮吸收，缓解患者骨转移癌痛13。骨癌痛小鼠模型造模成功后第21 d，中药外敷组小鼠缩足反应百分率（23.10±3.38）%比扶他林组（32.70±4.45）%和模型组（52.20±5.61）%少，差异具有统计学意义（P<0.05）；中药外敷组热刺激过敏为（14.10±3.68）s，比扶他林组（10.70±3.2

27、3）s和模型组（6.90±2.64）s延长，差异具有统计学意义(P<0.01)，说明芳香类中药外敷降低骨转移癌痛小鼠机械性痛觉和热刺激痛觉4；另外还对骨转移瘤有一定的抑制作用5。香辛方可以降低血IL-1水平和TNF水平，可能通过下调炎性介质表达起到缓解骨转移癌痛的作用。文献报道，丁香（油）可明显提高小鼠机械性压痛痛阈值14。其有效成分丁香苷对小鼠热板试验、醋酸扭体试验有一定镇痛作用15。细辛对抗炎、镇痛具有明确作用16，对多种疼痛动物模型具有良好的镇痛作用。与吗啡比较，其镇痛作用起效慢, 但作用时间长17。目前，中医外治癌痛的常见机制有，抑制炎性介质，抑制破骨细胞活化，抑制脊髓

28、初级感觉神经元活化，抑制中枢敏化，抑制离子通道等。肿瘤组织及周围的炎性细胞，如巨噬细胞、T淋巴细胞和内皮细胞等，可分泌不同类型的炎性介质，包括TNFa、内皮素-1、IL-1和IL-6等，通过各自的受体，直接或间接致敏初级传入神经元18。骨内和周围的初级传入神经元含有独特的蛋白，协助骨癌痛相关的温度，机械性或化学刺激的传导19。同时，还涉及其他间接机制，如肿瘤相关免疫调节，骨细胞以及肿瘤微环境中释放的介质诱导温度、机械和化学刺激，随后引起疼痛感受器的激活。同时，本研究结果显示，骨癌痛模型小鼠脊髓MCP-1的表达上调，提示骨癌痛小鼠出现了痛觉中枢敏化，这与以往的研究结果一致。中药外敷方可以使脊髓M

29、CP-1表达下降，抑制中枢敏化而起到止痛作用。有研究发现，在神经病理痛大鼠模型上，背根神经节和脊髓背角的磷酸化蛋白质激酶B阳性神经元显著增加20-21。金迪等22对骨癌痛大鼠鞘内给予MCP-1中和抗体后，脊髓p-Akt表达降低，并使机械痛阈明显降低，说明脊髓MCP-1可能通过激活PI3K/Akt信号通路参与了大鼠骨癌痛的形成。骨转移癌痛是机制复杂的慢性疼痛，中药复方对骨癌痛的镇痛也是从多环节、多因素来发挥作用的。本方对肿瘤生成的其他分子机制是否仍有抑制作用，我们将在下一步的课题研究中继续深入研究。参考文献：1 Clohisy D, Mantyh P. Bone cancer pain J. C

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