生物细胞产生的酶有两类一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用

1、酶的别离纯化之前处理生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进 行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄 糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。 这 类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到 细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、 味精的发酵生产所进行的一系列化学反响，就是在多种酶催化下在细 胞内进行的，这类酶在细胞内往往与细胞结构结合， 有一定的分布区 域，催化的反响具有一定的顺序性，使许多反响能有条不紊地进行。 酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的， 但每一种酶的含量却很

2、低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多， 但各种酶的含量却差异很大。因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰 富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的 好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制， 如不能综合利用，本钱又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方 法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多， 既 不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找 到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量， 用廉价原料可以大量生产。由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外， 往往还有 许多其它酶和一般

3、蛋白质以及其他杂质， 因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手段酶是具有催化活性的蛋白质， 蛋白质很容易变性， 所以在酶的提 纯过程中应防止用强酸强碱， 保持在较低的温度下操作。 在提纯的过 程中通过测定酶的催化活性可以比拟容易跟踪酶在别离提纯过程中 的去向。酶的催化活性又可以作为选择别离纯化方法和操作条件的指 标，在整个酶的别离纯化过程中的每一步骤， 始终要测定酶的总活力 和比活力， 这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶， 纯度提高了多 少，从而决定着一步骤的取舍。酶的别离纯化一般包括三个根本步骤：即抽提、纯化、结晶或制 剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液， 此时不可防止地夹带着一些 杂质，

4、然后再将此酶从溶液中选择性地别离出来， 或者从此溶液中选 择性地除去杂质， 然后制成纯化的酶制剂。 下面就酶的别离纯化的常 用方法作一综合介绍： 一、 预处理及固液别离技术1. 细胞破碎( cell disruption )高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆 菌甚至黑曲霉菌。 将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔 中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通 过均质器的细胞破碎率在 12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。 要到达 90%以上的细胞破碎率，起码要将菌悬液通过均质器两次。最 好是提高操作压力，减少操作次数。但有人报道，当操作压力到

5、达 175Mpa时，破碎率可达100%当压力超过70Mpa时，细胞破碎率上 升较为缓慢。 高压均质器的阀门是影响细胞破碎率的重要因素。 丝状 菌会堵塞均质器的阀门， 尤其高浓度菌体时更是如此。 在丰富培养基 上比在合成培养基上生长的大肠菌更难破碎。 容菌酶处理法：蛋清中含有丰富的溶菌酶，价格廉价，常用来裂解细 胞。具体做法是：溶壁微球菌 micrococcus lysodeikticus43kg ， 置于0.5%的氯化钠溶液中，使细胞浓度为5干重，在35C用0.68kg干重的蛋清处理20min,得到的细胞碎片用相同体积的乙醇处理， 用离心机将细胞碎片和胞内蛋白质除去， 再将乙醇浓度提高到 75

6、%体 积分数,可以得到纯度为 5%的过氧化氢酶 1500g。2. 离心离心别离过程可分为离心过滤、离心沉淀、离心别离3种类型,所使用的设备有过滤式离心机、 沉降式离心机和离心机。 过滤式离心 机的转鼓壁上开有小孔, 壁上有过滤介质, 一般可用于处理悬浮固体 颗粒较大、固体含量较高的场合。 沉降式离心机用于别离固体浓度较 低的固液别离, 如发酵液中的菌体, 用盐析法或有机溶剂处理过的蛋 白质等。别离机用于别离两种互不相溶的、 密度有微小差异的乳浊液 或含微量固体微粒的乳浊液。在生物领域采用的离心机系统,除了应具备离心机的一般要求 外,还应满足生物生产的技术要求,这包括灭菌、冷却、密封,以保 证产

7、品不受污染并不污染环境。现代哦离心机装置包括以下三个步 骤,并进行程序控制：离心、离心系统的灭菌及就地清洗。如阿法 - 拉伐公司离心机产品的装置, 具有双重轴向密封, 密封由装在转筒主 轴上下的碳化硅动环和固定环组成， 密封由水连续冷却和润滑， 可防 止产品被污染， 也可防止生产过程中排出的废物对环境的污染。 该离 心机又如一个密闭的压力容器，可在 121C温度下进行蒸汽灭菌，该 离心设备设有环绕离心机转筒的冷却夹套， 对悬浮液和浓缩的固体都 能进行充分的冷却， 并能有效地控制温度， 这对于生物制品是非常重 要的。如BTPX205型离心机可用于细胞收集、培养液的净化和细胞碎 片的别离，可用于疫

8、苗、酶制剂等的提取。该机的其他辅助系统及控 制系统也较为完善，如设有压力指示器、力量计、温度传感器和液面 传感器。3膜别离技术 在蛋白质纯化过程中主要用到的膜别离技术多为超滤。 在静压作 用下降溶液通过孔径非常小的滤膜， 使溶液中分子量较小的溶质透过 薄膜，而大分子被截留于膜外表。 大多数超滤膜是由一层非常薄的功 能膜与较厚的支撑膜结合在一起而组成的。功能膜决定了膜的孔径， 而支撑膜提供机械强度以抵抗静压力。 超滤浓缩的优点是： 操作条件 温和，无相变化，对生物活性物质没有破坏。超滤系统主要由料液贮罐、泵、超滤器、透过液收集罐组成，料 液经泵打入超滤器， 水及低分子量物质排出超滤器外， 被浓缩

9、的料液 在料液贮罐、泵、 及超滤器中循环。当料液浓缩至一定的倍数后即可 作为进一步处理的浓缩料液。超滤应用于蛋白质类物质的浓缩和脱盐过程中时应注意以下问 题：第一，在超滤循环过程中， 由于泵和叶轮与料液的摩擦放热作用， 料液的温度会逐渐升高，会造成蛋白质分子的损失。因此，料液贮罐 应加冷却系统，并安装自动测温及控制系统。第二，某些酶的辅助因 子散失为问题：一些酶含有辅助因子，其分子量小，超滤时易从透过 液中排除掉，因而在超滤前或超滤后要添加一定浓度的的辅助因子。 还可将超滤与亲和层析相结合以提高别离纯度。 其工作原理是： 当溶 液中欲被别离的蛋白质不受阻碍地通过超滤膜的孔隙时， 如果在膜的 一

10、侧结合着亲和配基， 该蛋白质就会与配基结合因而结聚在膜的这一 侧。不与配基结合的其他物质就将穿过孔而被带走。 再用适宜的洗脱 剂将该蛋白质洗脱下来，洗脱液用于进一步的别离纯化。4. 泡沫别离技术将气体通入含多种组分的溶液中， 由于这些组分的外表活性由差 异，因此在溶液的外表，某些组分将形成泡沫，泡沫的稳定性取决于 操作条件及溶液的生物学特性。 泡沫中含有更多的外表活性成分， 故 泡沫的组分种类及其含量与溶液中的不相同。 这样，溶液中的组分就 得以别离。蛋白质较易吸附与气液界面， 这有利于其结构的稳定。 泡沫别离 过程是： 蛋白质从主体溶液中扩散到气液界面， 该过程可能是可逆的 也可能是不可逆的

11、；分子发生重排，一般认为在空气 - 水界面会形成 两种类型的膜，一种是稀膜，另一种是浓膜，可能会发生由多个分子 聚集在一起的现象。 在气液界面形成的蛋白质膜可以是单层的也可以 是多层的。 膜的类型取决于主体溶液及气液界面上蛋白质的特性、 结 构和浓度。泡沫别离的目的， 一方面提高酶蛋白的富集率 泡沫中蛋白质的 浓度/最初溶液中蛋白质浓度 ，另一方面提高酶蛋白的提取率 泡沫 中蛋白质的提取率 / 最初的蛋白质质量 ，或使多组分混合物中某一组 分的分配系数最大 二、抽提、沉淀1. 盐析常用的盐析剂是硫酸铵，其溶解度大、价格廉价。硫酸铵沉淀蛋 白质的能力很强， 其饱和溶液能使大多数的蛋白质沉淀下来。

12、 对酶没 有破坏作用。pH 的控制：应从酶的溶解度与稳定性两个方面考虑，在酶等电 点时其溶解度最小易沉淀， 但有些酶再等电点时稳定性较差， 因此要 选择最正确pH值.一般要求在酶最稳定的pH值的前提下再考虑最适宜 酶沉淀的pH值。在操作中一旦确定最正确pH值后，在添加硫酸铵之前 甲酸或碱调节好酶液的pH值，要尽量防止溶液pH值的波动以免破坏 酶的稳定性。在添加硫酸铵时要注意搅拌， 并注意硫酸铵的参加速度， 一般是由少到多，缓慢参加，硫酸铵尽可能磨成细粉。温度的控制： 有些酶在较高温度下稳定性能较好， 可在常温下进 行盐析操作，而对于大多数酶，尽可能在低温下操作。酶液的净置： 加完硫酸铵后，酶液

13、要静置一段时间，使酶蛋白完 全沉淀下来，酶静置后，就不要再加以搅拌。2有机溶剂沉淀有机溶剂选择：可用于酶蛋白沉淀的有机溶剂包括醇类物质等，如甲醇、乙醇、异丙醇。乙醇的亲水性能较好， 可防止蛋白质的变性， 酶蛋白在其中的溶解度也较低。有机溶剂沉淀操作： 有机溶剂一般都使蛋白质变性， 当温度较高 时变性蛋白质分子就会变成永久失活。 因此用有机溶剂处理时最好在 0C以下进行。用有机溶剂沉淀得到的酶蛋白不要放置过久，要尽快 加水溶解。3. 聚合物絮凝剂沉淀 聚合物絮凝剂，如葡聚糖和聚乙二醇，与酶分子争夺水分子，具 有脱水作用使酶沉淀。聚乙二醇作为一种沉淀剂的优点是在水溶液 中，其浓度可到达 50%，浓

14、度为 6%-12%的蛋白质大都可以沉淀下来。 这种试剂不需要低温操作，而且对蛋白质的稳定还有一定的保护作 用。聚乙二醇不会被吸附，故在离子交换吸附前不必去除。 4用金属离子和络合物沉淀酶和其他蛋白质都会形成金属盐， 其溶解度较低。 用金属离子沉 淀的缺点是酶与金属离子相互作用后， 可逆变化较差， 尤其是用巯基 衍生物，它结合的 金属离子会催化酶变性而失活。5用特殊试剂沉淀法用链霉素可选择性去除核酸， 从而使胞内酶沉淀出来。 链霉素盐 浓度为 蛋白质对于选择性沉淀核酸的效果比锰离 子还要好，酶不易失活。6亲和沉淀 将亲和反响的高度选择性、低处理量特性与沉淀操作的大处理 量、低选择性有机结合形成了亲和沉淀技术。 将配基与可溶性载体偶 联后形成载体 - 配基复合物，该复合物与生物分子结合后在一定条件 下可以沉淀出来。配基-载体复合物可以选择性地与蛋白质结合，溶液中的 pH值、 离子强度及蛋白质浓度等条件对亲和结合的影响力并不大， 只有竞争 性的配基会降低产物与原配基的亲和结合力， 甚至使亲和结合发生逆 转。引导产生沉淀的方法有：离子交联；参加带相反电荷的聚合物； 参加带相反电荷的疏水基团；改变 pH值，诱导产生疏水沉淀；温度 诱导产生沉淀。亲和结合：将亲和配基参加到含有目的物蛋白质的溶液中， 调节 好有关沉淀的条