药代动力学实验

1、药物代谢动力学实验药物代谢动力学实验2012年年10月月16日日编辑ppt神农尝百草神农尝百草 传说神农一生下来就是个“水晶肚”，几乎是全透明的，五脏六腑全都能看得见，还能看得见吃进去的东西。那时候，人们经常因乱吃东西而生病，甚至丧命。神农为此决心尝遍百草，能吃的放在身体左边的袋子里，介绍给别人吃；不好吃的就放在身体右边袋子里，作药用。不能吃的就提醒人们注意。编辑ppt3药物代谢动力学药物代谢动力学定量研究药物（包括外来化学物质）在生物体内吸收、分布、排泄和代谢（简定量研究药物（包括外来化学物质）在生物体内吸收、分布、排泄和代谢（简称体内过程）规律的一门学科。称体内过程）规律的一门学科。常用测

2、常用测定方法定方法 HPLC-UV ?GC-MS ? LC-MS/MS ?编辑ppt 1.HPLC原理与标准操作规程(SOP) 2.实验设计与动物实验 3.样品处理与方法开发 4.定性定量与分析测定 5.数据处理与药动学参数计算 6.实验报告实验安排实验安排静注加替沙星在家兔体内的药代动力学研究静注加替沙星在家兔体内的药代动力学研究编辑pptHPLC原理与标准操作规程原理与标准操作规程(SOP)1.HPLC的组成2.分配色谱的原理3.色谱柱4.流动相5.定性与定量方法6.样品的预处理7.反相色谱分析方法的开发编辑ppt High Performance Liquid Chromatograph

3、y HPLC 的组成 Pump 泵 Injector/Autosampler 进样器/自动进样器 Column 色谱柱 Detector 检测器 Data System/Integrator 数据系统/积分仪表编辑ppt高效液相色谱系统色谱泵进样器检测器数据处理色谱柱编辑ppt高效液相色谱系统SHIMADZU LCMS-2010EVLC-MS/MS Thermo TSQ Quantum Access编辑ppt分配色谱的分离机理编辑ppt分配色谱概述 反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离 洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱 常用的流动相： 有机溶剂如甲醇、乙腈，水 应用添加剂，成为离子对

4、、离子抑制方法 常用固定相： 碳十八、碳八、胺基等基团 反相色谱固定相多为键合相编辑ppt对HPLC柱的了解 色谱柱分类 填料，含碳量，基质，粒径 色谱柱的应用 正相柱，反相柱，预处理柱 色谱柱的规格 岛津 Shimadzu VP-ODS; 150L2.0; 5m; 柱号 8082693.编辑ppt键合相色谱柱 以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。 优点 固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响 缺点 pH值不能小于3 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同编辑ppt反相C18色谱柱的活化 步骤一：步骤一： 90%甲醇1mL/m

5、in流速冲洗30min 步骤二：步骤二： 10%甲醇1mL/min流速冲洗30min 步骤三：步骤三： 90%甲醇1mL/min流速冲洗60min编辑ppt色谱柱的存放 存放前的处理 除去杂质、盐 合适的存放溶剂 避免色谱柱床的干枯 避免机械震动 防止细菌生长 注意存放的温度编辑ppt液相色谱对流动相的要求 除色谱柱对流动相对的要求外，还有 与检测器匹配 脱气脱气 避免卤素离子（不锈钢系统） 溶剂的粘度 细菌的生长编辑ppt流动相的脱气 流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确 输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加

6、溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱 减少死体积 防止填料的氧化编辑ppt流动相脱气的方法 加热 简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化 抽真空抽真空 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果 超声波超声波 简单，但效果不理想。 通惰性气体（一般用氦气） 可保持连续脱气，多用于低压梯度 脱气机 可保持连续脱气，多用于低压梯度编辑ppt色谱峰定性 鉴别每个色谱峰 通过比较保留值(通常是保留时间保留时间)的方法，找到各色谱峰所对应的组份 大多数情况下用比较保留时间来定性即所谓：保留时间相同，可能是同样的组份保留时间不同，肯定不是同样的组份编辑ppt用保留时间定性 用“标样

7、”的保留值定出被测组份的位置0.000.050.100.150.200.250.300.350.400.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00AUMinutesUracilEthylparabenPropylparaben编辑ppt标准加入法举例 废水样品中五氯苯（PCP）的分析PCP4 ppm3 ppm2 ppm1 ppm编辑ppt常用的定量方法 峰面积百分比法峰面积百分比法 由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用 外标法外标法 在液相色谱中用的最多 内标法内标法 准确，但是麻烦 在标准方法中用的最多编辑ppt外标

8、法定量 配制一系列已知浓度的标样编辑ppt外标法定量（二） 实际色谱图0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0M in u te s0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06

9、.5 07 .0 0M in u te s0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0M in u te s05010015020025001,0002,0003,0004,0005,000样品浓度响应值峰面积()标准曲线编辑ppt内标法定量（一） 配制一系列浓度的标样，其中加有内标样编辑ppt内标法定量（二） 实际色谱图0.000.200.400.600.801.001.20

10、1.401.601.802.002.503.003.504.004.505.005.506.00voltsMinutesM ethylParabenEthylParabenPropylParabenButylParaben05010015020025001020304050样品浓度标样峰面积内标样峰面积标准曲线编辑ppt内标法定量（三） 对内标物的要求对内标物的要求 化学结构与待测组分相似(同系物、异构体) 在样品中不存在 不与样品中组份发生任何化学反应 保留值与待测组分接近 浓度（响应值）与待测组分相当 其色谱峰与其他色谱峰分离好编辑ppt可接收的检测范围 校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范

11、围内有效，高或低于这些点都可能引起计算错误最低浓度标样最高浓度标样所希望的检测范围线性问题灵敏度问题检测器响应样品浓度编辑ppt样品的预处理 样品预处理的目的 除去微粒 减少干扰杂质 浓缩微量的组份 提高检测的灵敏度及选择性 改善分离的效果 有利于色谱柱及仪器的保护编辑ppt样品的预处理重要性 占样品分析时间的比例 样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间 占分析的消耗总成本最大 消耗大量的溶剂及其他化学品 实验的重复性及准确性最差的环节 影响实验结果好坏的最重要因素 是决定性的步骤是决定性的步骤编辑ppt样品预处理常用的方法 高速离心 过滤、超滤 选择性沉淀选择性沉淀 衍生反应 液液-固萃取固

12、萃取 / 液液-液萃取液萃取 Sep-Pak样品处理小柱 其他编辑ppt选择性沉淀 常用于生化样品中除蛋白 有机溶剂 乙腈，甲醇 强酸 三氯乙酸，过氯酸 盐 50% 硫酸铵 10% TCA编辑ppt样品分析时第一步干什么? 想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法 查文献，如CA(化学文摘) 仪器制造商的文献，如Waters 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法 充分了解您自己的样品编辑ppt分析时要了解哪方面的情况？ 灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法

13、容易使用? 编辑ppt使用文献方法 色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法的流动相 是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度）编辑ppt反相色谱的方法开发 开发过程实例 色谱条件 色谱柱：C18，4mm30mm 流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 流速：2ml/min 样品： 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)编辑ppt改变流动相

14、比例60/4050/5040/60谱图编辑ppt改变流动相组成 通过改变流动相改变选择性 同样强度的不同溶剂 改变色谱柱62:38/42:58/72:28/2322，OHCNCHOHMeOHOHTHF编辑ppt离子型化合物的分离方式 使用离子交换柱 离子交换法 主要用于“强”阴、阳离子 使用反相柱 离子抑制色谱法 通过改变流动相的pH值，使样品成中性 离子对色谱法 加入“对离子”，使样品呈中性编辑ppt离子抑制色谱 离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离 适用于弱酸性化合物的分离 降低流动相的pH值，使样品降低离子化 使用硅胶基质C18填料 使用条件应在填料基

15、质的范围内 硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内编辑ppt常用缓冲液及其pH值编辑ppt离子抑制色谱实例 在乙腈/水及pH=7时，多数保留时间很短，无法完全分离。CHOOHOCH3COONaCHOCOOHOCH31234编辑ppt其他精密仪器操作标准操作规程其他精密仪器操作标准操作规程(SOP)(SOP)要点要点高速冷冻离心机：高速冷冻离心机：配平、十字交叉十字交叉、样品选择普通离心机：普通离心机：配平、十字交叉、样品选择万分之一电子天平：万分之一电子天平：称量量程范围、记录、保养紫外可见光分光光度计：紫外可见光分光光度计：预热、样品量、校准涡旋振荡器：涡旋振荡器：涡旋程度超声机：超声机：超声效果、时间编辑ppt药代动力学实验室的要求药代动力学实验室的要求1.环境的要求：灰尘、湿度、阳光是分析仪器的大敌2.所写即所做3.分析测定用试剂为色谱纯及以上，水为超纯水4.痕量分析对实验人员有较高要求5.对仪器设备的操作严格按照SOP执行，专人管理和 维护保养6.良好的实验习惯编辑pptHPLC-UVHPLC-UV测定加替沙星的血药浓度如何着手？测定加替沙星的血药浓度如何着手？查文献：中国优秀期刊论文数据库、查文献：中国优秀期刊论文数据库、pubmedpubmed需要关注的问题：色谱柱的选择需要关注的问题：色谱柱的选择 流动相的组成流动相的组成 柱温箱的温度柱温箱的温