液相色谱的方法开发(一)分离方法-Waters LC School 培训教材_图文

1、液相色谱的方法开发一分离方法 第一步干什么?想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品或有否类似 样品的分析方法查文献如CA(化学文摘仪器制造商的文献如Waters对色谱柱有足够的了解掌握分离机理自己开发方法充分了解您自己的样品分析时要了解哪方面的情况灵敏度的要求有多高?样品的本底是否很复杂?有多少组份要分析?对分析的精确度准确度等有多高要求? 是否因是日常检验而要求方法容易使用? 分离时要了解哪方面的情况 要分离即制备的样品量有多大?要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量?是否需要保持生物活性?对分离产物纯度的要求有多高?纯度或活性的鉴定如何完成?一般的具体步骤先用一根短的色谱柱用相对

2、较高的流速使用尽可能纯度高的标准品先用高强度的洗脱液调节k 值改变保留值调节值改变选择性调节柱长度改变柱效及分离速度请记住 每次改变一个参数使用文献方法色谱柱填料的种类品牌是否相同? 注意文献方法的流动相是否损害色谱柱?如色谱填料品牌不同需要调整流动相注意色谱柱的规格内径柱长 需要调整流速进样量注意梯度条件 了解系统的滞后体积梯度色谱方法转换如果没有与文献或要求相近的色谱柱转换进样量转换流速长度内径进样量初始初始现在现在初始=L D L D L D Load Load 22(内径流速初始现在初始=D D D F F 22(反相色谱的方法开发开发过程实例色谱条件 色谱柱C184mm30mm 流动

3、相乙腈/水不同的溶剂强度60/40 50/5040/60由强渐弱 流速2ml/min样品 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben 改变容量因子K 60/4050/5040/60谱图改变选择性通过改变流动相改变选择性同样强度的不同溶剂 改变色谱柱62:38/42:58/72:28/232 2OHCNCHOHMeOHOHTHF离子型化合物的分离方式 使用离子交换柱离子交换法主要用于强阴阳离子使用反相柱离子抑制色谱法通过改变流动相的pH值使样品成中性离子对色谱法加入对离子使样品呈中性离子抑制色谱离子

4、型化合物在反相色谱柱上不保留改变流动相的pH值抑制样品离子的电离 适用于弱酸性化合物的分离降低流动相的pH值使样品降低离子化使用硅胶基质C18填料使用条件应在填料基质的范围内硅胶柱的pH在2-8较保险值3-7内常用缓冲液及其pH值名称pKaPhosphoric Acid 磷酸 2.12 (pKa1 Formic Acid 甲酸 3.75Succinic Acid 琥珀酸 4.19 (pKa1 Acetic Acid 乙酸 4.75Succinic Acid 琥珀酸 5.57 (pKa2 Phosphoric Acid 磷酸 7.21 (pKa2 Boric Acid 硼酸 9.24Phosph

5、oric Acid 磷酸12.32 (pKa3离子抑制色谱实例在乙腈/水及pH=7时多数保留时间很短无法完全分离CHOOHOCH3COONa CHO COOHOCH3 1234离子抑制色谱的使用范围如果 一些酸在pH低于2时还保持离子化一些碱在pH高于7时还保持离子化可以有以下的选择离子交换色谱使用聚合物反相柱在pH高于7时用离子抑制法使用离子对色谱法 在高pH值下用离子抑制色谱柱D18-613(聚合物基质室温 流动相乙腈/0.01M NH4OH + 0.01M TBA流速 1.0ml/min检测UV-240nm样品巴比妥的衍生物巴比妥 己琐巴比妥 甲基苯巴比妥 速可巴比妥 离子对色谱法 在反

6、相色谱流动相内加入离子对试剂与样品中可电离的组份形成对离子在反相色谱柱上分离离子型化合物离子对试剂的类型PIC A磷酸季丁铵适用于弱酸PIC B烷基磺酸盐适用于弱碱烷基长度不同形成对离子的能力不同通常有B5B6B7B8 PIC D4磷酸二丁胺适用于弱碱离子对色谱机理用离子对还是离子抑制中性物质PIC A 酸性物质PIC B 碱性物质R SO 3H R C OH OR O S OH O O R OPOH O O R NH 2R 2N H R 3N (R 4N +-CH 3OH / 0.01M (NH 42HPO 4CH 3CN / H 2OCH 3OH / H 2O磺酸染料苯甲酸马来酸雌酮磷酸地

7、塞米松氢化可的松对苯二甲酸二乙脂苊多巴胺VB2肾上腺素可待因洁尔灭离子抑制CH 3OH / 1%HAc CH 3CN / NaH 2PO 4离子对色谱的应用 抗组胺及减充血剂药物的分析使用五烷基磺酸盐Packing: Packing: Bondapak Bondapak C C 18Column: Column: 4 mm ID x 30cm 4 mm ID x 30cmSolvent: Solvent: Methanol/H 2O with 0.005M PENTANE Sulfonic Sulfonic Sulfonic Acid & 1% Acid & 1% Acid & 1% HOAc

8、 HOAc HOAc (50/50 (50/50Flow Rate: 2.0 ml/minDetector: UV, 254Detector: UV, 254 nm nm nm, 0.1 AUFS , 0.1 AUFS 1. 1. Maleic Maleic Maleic Acid Acid 2.2. Phenylephrine Phenylephrine 3. 3. Phenylpropanol Phenylpropanol Phenylpropanol-amine 4.4. Naphazoline Naphazoline 5.5. Phenacetin Phenacetin 6.6. Py

9、rilamine Pyrilamine使用六烷基磺酸盐Packing: Bondapak Bondapak C C 18Column: 4 mm ID x 30cmSolvent: Methanol/Water with 0.005M HEXANE Sulfonic Sulfonic Sulfonic A c id & 1% & 1% HOAc HOAc HOAc (50/50 (50/50Flow Rate: 2.0 ml/minDetector: UV, 254Detector: UV, 254 nm nm nm, 0.1 AUFS , 0.1 AUFS1. 1. Maleic Malei

10、c Maleic Acid Acid2.2. Phenylephrine Phenylephrine Phenylephrine-HCl HCl3.3. Phenylpropanolamine Phenylpropanolamine Phenylpropanolamine-HCl HCl4.4. Naphazoline Naphazoline Naphazoline-HCl HCl5.5. Phenacetin Phenacetin6. 6. Pyrilamine Maleate Pyrilamine Maleate使用七烷基磺酸盐1. 1. Maleic Maleic Maleic Acid

11、 Acid2.2. Phenylephrine Phenylephrine3.3. Phenylpropanolamine Phenylpropanolamine4.4. Naphazoline Naphazoline5.5. Phenacetin Phenacetin6.6. Pyrilamine PyrilaminePacking: Bondapak Bondapak C C 18Column: 4 mm ID x 30cmSolvent: Methanol/Water with 0.005M HEPTANE Sul Sul f onic onic A c id & 1% & 1% HOA

12、c HOAc HOAc (50/50 (50/50Flow Rate: 2.0 ml/minDetector: UV, 254Detector: UV, 254 nm nm nm, 0.1 AUFS , 0.1 AUFSPIC-B7的浓度很低为0.001M在样品浓度较大时 如右图第号峰由于PIC不足而分叉 离子对色谱分析水溶性维生素NCONH 2NH 3C HOCH 2OHCH 2OH NN NNH 3C H 3COO CH 2CH CH CH HO HOHO CH 2O H NNH 3CNH 2CH 2NSCH 2CH 2OHCH 3 Cl -+1. Niacinamide 烟酰胺2. Py

13、ridoxine 吡哆素 VB63. Riboflavin 核黄素 VB24. Thiamine 硫胺素VB 1用不同的离子对试剂 BondaPak C18 3.9mm 300mm 溶剂 1.MeOH/H2O,PIC-B7 2.MeOH/H2O,PIC-B5 3.MeOH/H2O,PIC-B7/B5 色谱柱 1.如用PIC-B7 在 分开的情 况下 保留时间 太长 2.如用PIC-B5 峰 分不 开 3.如用PIC-B7 加B5 各组份 分开 且保留 时间合适 离子对色谱 - 水溶性维生素 保留时间与PIC试剂B之间的关系 36ml 保留体积 ml 胺 1 B (V 硫 核黄素(VB2 6 素(VB 吡哆 烟酰胺 4ml B5 50%(B5/