海马论文血管性痴呆大鼠海马胆碱乙酰基转移酶的动态变化

1、海马论文|血管性痴呆大鼠海马胆碱乙酰基转移酶的动态变化    align=left作者：张立红 周永翠 王玉良    作者单位：潍坊医学院生理教研室，山东 潍坊 261042 /alignb【摘要】/b  目的 观察血管性痴呆（VD）模型大鼠海马组织胆碱乙酰转移酶（ChAT）与学习记忆功能的动态变化，探讨VD发病的可能机制。方法 采用双侧颈总动脉反复夹闭再灌注，同时腹腔注射硝普钠建立VD大鼠模型，在7、15 d、1、2、4个月等时间点，采用水迷宫检测大鼠学习记忆能力的变化，HE染色和免疫组化染色观察大鼠海马神经元的

2、形态学改变及ChAT表达的变化。结果 模型组大鼠各时间点的逃逸潜伏期（EL）比假手术组均明显延长(P0.01)；海马区锥体细胞数比假手术组明显减少(P0.01)；免疫组织化学观察海马ChAT阳性神经元表达均显著少于假手术组(P0.01)。而且随造模手术后时间的延长，以上变化逐渐加重，与水迷宫EL呈负相关（r=-0.937,P0.05）。结论 缺血再灌注后，海马胆碱能神经元进行性缺失与ChAT活性降低可能是VD大鼠学习记忆障碍的重要机制之一。b【关键词】/b  血管性痴呆；胆碱乙酰转移酶；学习记忆；大鼠The dynamic changes of choline acetyl

3、transferase in hippocampal neurons of vascular dementia rats     ZHANG LiHong, ZHOU YongCui, WANG YüLiang.     Department of Physiology, Weifang Medical University, Weifang 261053, Shandong, China     【Abstract】  Objectiv

4、e  To observe the dynamic changes of choline acetyltransferase（ChAT）in hippocampal neurons and the abilities of learning and memory of vascular dementia (VD) rats. Methods  VD rat models were established by repeatedly cerebral ischemiareperfusion. Morris water maze was used to de

5、tect the changes of the abilities of learning and memory, and HE staining and immunohistochemical staining were used to observe the changes of neurons′ morphology and ChAT expression in hippocampus. Results  (1) The escape latency (EL) of model group was obviously longer than tha

6、t of shamoperated (SO) group at different time point (P0.01). (2) The number of pyramidal neurons in hippocampal CA1 area of model group was lower than that of SO group (P0.01). (3) Compared with those of SO group, ChATpositive neurons in the hippocampus of model group were decreased significantly (

7、P0.01). The number of ChATpositive neurons was negatively correlated with the EL of Morris water maze test (r=-0.937,P0.05). Conclusions  After ischemiareperfusion, the loss, denaturation and necrosis of cholinergic neurons in hippocampus are progressively severe and positively correlated

8、with the extent of learning and memory impairment. These suggest that the loss and injuries of cholinergic neurons may play a key role in onset and development of VD.     【Key words】  Vascular dementia; ChAT; Learning and memory; Rat      近年来，人们对血管性痴

9、呆（VD)发病的胆碱能机制进行了大量的研究，越来越多的证据表明，VD时中枢胆碱能系统受损1，其认知损害机制涉及胆碱能神经递质及其受体的改变2。但在VD发生与发展过程中，脑内胆碱能神经元长时间的动态变化及其与学习记忆的相关性有待进一步研究。胆碱乙酰基转移酶（ChAT）是胆碱能神经元的特殊标志。本实验通过行为学和免疫组织化学方法，观察脑缺血再灌注所致的VD模型大鼠海马ChAT活性及ChAT阳性神经元在VD发病中的动态变化，探讨VD模型大鼠学习记忆障碍的可能机制。    b 1  材料与方法/b     1.1 

10、; 动物分组与处理  健康SD大鼠，34月龄，雄性，体重200250 g，由解放军第89医院实验动物中心提供。动物购回后饲养3 d，观察无异常，用Morris水迷宫筛选出较灵活的大鼠60只，随机抽取50只采用王蕊3改进方法复制VD大鼠模型，其余10只作为假手术组。假手术组麻醉及手术过程同模型组，但不予阻断颈总动脉及注射硝普钠。术后7 d行Morris水迷宫检测，以假手术组大鼠游到平台平均时间的95上限值为标准，将超出上限值的脑缺血再灌注大鼠确定为痴呆大鼠4。将造模成功的大鼠分为7、15 d、1、2、4个月时间点亚组，每亚组10只。在相应时间点检测相关指标。

11、0;    1.2  HE染色和免疫组化染色  Morris水迷宫检测后，各组大鼠用生理盐水和4多聚甲醛溶液经颈总动脉灌注取脑，至4多聚甲醛后固定12 h，流水冲洗30 min，乙醇梯度脱水，苯透明，浸蜡，常规包块。组织切片机切片，制备脑冠状面切片，片厚5 μm，展片于处理好的载玻片上，于60烤箱中烤片过夜，进行HE染色，光镜观察。采用SABC法进行免疫组织化学染色。组织切片常规脱蜡入水，0.3%H2O2溶液封闭,热抗原修复，5%BSA封闭液;滴加稀释的一抗(兔抗鼠ChAT抗体，武汉博士德生物工程公司)，4过夜

12、，滴加生物素化的羊抗兔IgG，37温箱孵育，滴加试剂SABC (武汉博士德生物工程公司)，DAB(北京中山生物技术公司)显色，镜下控制反应时间，梯度乙醇上行脱水、苯透明、封片，光镜下观察。染色结果判定以细胞内含有棕黄色染色颗粒为阳性染色细胞。光镜下(×400)选取细胞数较为恒定的CA1区中段拍片，每张照片取相同面积计数锥体细胞，3张切片的平均值为该样本的锥体细胞数。应用Mivnt图像分析系统进行图像分析。分别检测视野内总阳性细胞数量、阳性细胞总面积(像素单位)。1.3  HE染色和免疫组化染色  Morris水迷宫检测后，各组大鼠用生

13、理盐水和4多聚甲醛溶液经颈总动脉灌注取脑，至4多聚甲醛后固定12 h，流水冲洗30 min，乙醇梯度脱水，苯透明，浸蜡，常规包块。组织切片机切片，制备脑冠状面切片，片厚5 μm，展片于处理好的载玻片上，于60烤箱中烤片过夜，进行HE染色，光镜观察。采用SABC法进行免疫组织化学染色。组织切片常规脱蜡入水，0.3%H2O2溶液封闭,热抗原修复，5%BSA封闭液;滴加稀释的一抗(兔抗鼠ChAT抗体，武汉博士德生物工程公司)，4过夜，滴加生物素化的羊抗兔IgG，37温箱孵育，滴加试剂SABC (武汉博士德生物工程公司)，DAB(北京中山生物技术公司)显色，镜下控制反应时间，梯度乙醇上行

14、脱水、苯透明、封片，光镜下观察。染色结果判定以细胞内含有棕黄色染色颗粒为阳性染色细胞。光镜下(×400)选取细胞数较为恒定的CA1区中段拍片，每张照片取相同面积计数锥体细胞，3张切片的平均值为该样本的锥体细胞数。应用Mivnt图像分析系统进行图像分析。分别检测视野内总阳性细胞数量、阳性细胞总面积(像素单位)。     1.3  Morris水迷宫试验  各组大鼠分别在造模后7、15 d,1、2、4个月进行Morris水迷宫定位航行实验5,检测反映大鼠空间学习和记忆能力改变的逃逸潜伏期（EL）。

15、     1.4  统计学处理  数据以x±s表示，应用SPSS11.5软件进行采用方差分析、t检验和相关分析。  b   2  结  果/b     2.1  行为学变化  与假手术组相比，模型组大鼠各时间点EL均明显延长(P0.01，P0.05)；模型组各时间点EL除2和4个月组差异不显著外(P0.05)，其余各组间均差异显著（P0

16、.01，P0.05），见表1。     2.2  HE染色结果  光镜下观察（图1）海马CA1神经锥体细胞层，假手术组无明显病理改变，海马神经细胞形态结构正常，无变性，海马锥体细胞23层，排列紧密，细胞核圆而大，染色浅，核仁清晰，细胞质丰富，胶质细胞无增生，神经纤维排列整齐。模型组大鼠CA1区锥体细胞层次减少，排列稀疏，细胞脱失，神经元变形坏死，细胞核体积变小，深染，结构不清，呈核固缩表现，神经纤维排列紊乱，胶质细胞增生。表1  各组大鼠海马CA1区ChAT阳性神经元、EL比较 与假手术组比较：

17、1）P0.05，2）P0.01；模型7 d组比较：3）P0.05,4）P0.01;与模型15 d和1个月组比较：5）P0.05图1  海马CA1区HE染色（×400）     图2  海马CA1区ChAT免疫组化染色（×400）2.3  免疫组化的结果  见图2。各组大鼠海马切片中均可见棕黄色阳性颗粒分布于神经元的胞浆中。假手术组大鼠海马结构CA1、CA2、CA3及DG区均有大量ChAT免疫反应阳性神经元分布，其中以海马锥体细胞层和颗粒

18、细胞层最密集，免疫反应阳性神经元显色清晰。模型组7、15 d海马ChAT免疫反应阳性神经元明显减少，显色较浅，胞体萎缩，突起萎缩、变短，且随时间点延长丢失加重。模型1、2、4个月组ChAT免疫反应阳性神经元减少非常明显，有的阳性神经元成空泡状，甚至消失，着色浅。图像分析表明，与假手术组相比，各模型组ChAT免疫反应阳性神经元数量及总面积均减少(P0.01)，说明各模型组大鼠脑内胆碱能系统受损。各模型组间比较，ChAT免疫反应阳性神经元数量及总面积除2和4个月组间差异不显著外(P0.05)，其余各组间均存在显著性差异（P0.05，P0.01）。     2

19、.4  EL与ChAT相关性分析  相关分析表明，水迷宫EL与ChAT阳性神经元计数呈现负相关（r=-0.937，P0.05）。水迷宫EL与阳性细胞总面积呈负相关（r=-0.995，P0.01）。b    3  讨  论/b     目前认为，大脑反复缺血再灌注是造成VD的主要原因之一6，7。建立可复制的可靠动物模型是研究VD发生发展机制及防治措施、疗效评价的关键。本实验通过双侧颈总动脉反复夹闭再通结合腹腔注射硝普钠降压法，建立了学习记忆障碍的大鼠痴呆模型

20、。经Morris水迷宫测试表明，模型组大鼠各时间点的EL均比假手术组明显延长，表明模型组大鼠学习、记忆功能受损，而且造模后的时间越长，模型组大鼠EL逐渐延长，提示大鼠造模后，随着造模时间的延长，学习记忆能力逐渐下降，痴呆程度逐渐加剧，造模2个月后学习记忆能力虽有继续下降趋势，但脑损伤程度进展比较缓慢，表明其学习记忆能力随时间的延长而降低。这与赵小贞8等的研究结果是一致的。提示脑损害在一定时间内逐渐加重，病情仍在进展，与VD发生、发展的慢性特征相符。      ChAT是乙酰胆碱(ACh)的合成酶，它在胆碱能神经元细胞体内合成，与ACh的分布几乎平行，是胆

21、碱能神经元的特殊标志。故常可以作为研究胆碱能神经的标志或估计Ach含量的间接指标。Ishimaru等10报道，造模4 d后，在CA1区辐射层几乎所有的免疫反应性ChAT消失，28 d后，免疫反应性ChAT完全消失。本结果表明，模型组大鼠各时间点海马CA1区ChAT免疫反应阳性神经元数量减少，分布稀疏，显色浅，且随着造模时间的延长，ChAT免疫反应阳性神经元数量及总面积逐渐下降，这与水迷宫测试所得到的行为学结果是一致的。     海马是与学习记忆等大脑高级功能密切相关的重要脑区，海马结构为大脑边缘系统的重要组成部分，在学习、记忆等高级神经活动中起重要作用。

22、实验表明，损毁双侧海马严重影响大鼠空间作业的认知能力9，并可导致迷宫学习的严重障碍。海马是对脑缺血最敏感的部位之一，脑缺血再灌注后，海马CA1区神经元发生迟发性坏死。因此，海马CA1区神经元的不可逆性损伤是造成学习记忆障碍的基础。本实验脑组织病理形态学结果证明，模型组大鼠各时间点海马CAl区神经细胞数目均减少，出现深染萎缩的细胞，且随着造模时间的延长，海马CA1区细胞脱失更为明显，而且CA2、CA3区细胞也有严重脱失，到24个月时，海马组织仅见少量残存的不规则细胞，胶质细胞明显增生，形成结节，提示海马病变逐步加重。结合对大鼠的水迷宫行为学测试，说明脑缺血再灌注损伤后，引起海马的神经元坏死，数量

23、减少，而残存神经元功能下降，从而影响大脑高级功能，导致学习记忆能力障碍。     本实验还观察到，随着造模时间的延长，模型组大鼠海马CAl区ChAT免疫反应阳性神经元和纤维数量逐渐减少，说明脑缺血再灌注后，脑内胆碱能系统受损，而且在一定时间（4个月）内，随着脑缺血再灌注后时间的延长，海马胆碱能系统受损的程度逐渐加重，并与痴呆大鼠的学习记忆障碍呈正相关（与模型组大鼠的EL呈负相关）。其原因可能与反复短暂脑缺血对脑组织产生累积损伤效应，造成了对脑组织缺血敏感区海马的明显损害。特别是胆碱能神经元数量减少，而残存神经元ChAT活力降低，ACh减少，脑内胆碱能受体

24、数目减少，造成胆碱能系统尤其是基底前脑胆碱能细胞及海马胆碱能投射纤维功能障碍，继而导致学习记忆功能障碍。本实验进一步从形态学上提供了VD模型大鼠海马区ChAT阳性神经元及纤维密度减低的证据，提示中枢胆碱能神经元的损伤可能是VD出现长期认知功能受损的形态学基础。     总之，本研究提示，海马胆碱能神经元受损是导致VD模型大鼠长期存在学习记忆障碍的机制之一，其他方面的机制尚需待进一步研究。b【参考文献】/b  1 Grantham C，Geerts H.The rationale behind cholinergic drug treatment for dementia related to cerebrovascular diseaseJ.J Neurol Sci，2002；203（1）:1316.2 Erkinjuntti T. Cognitive decline and treatment options for patients with vascular dementiaJ.Acta Neurol Scand Suppl，2002；178（1）:158.3 王 蕊,杨秦飞,唐一鹏,等.大鼠拟血管性痴呆模型的改进J.中国病理生理杂志,2000；16(10):9146.4 莫飞智，李建强，