新生大鼠心肌细胞的原代培养及鉴定 - 图文-

1、·基础研究·新生大鼠心肌细胞的原代培养及鉴定胡保奎,耿召华,祝善俊,刘玉峰(第三军医大学新桥医院心血管内科,重庆400037摘要目的:探讨新生大鼠心肌细胞原代培养的方法,培养存活率高和纯度高的心肌细胞。方法:无菌条件下取出出生1 2d 的SD 大鼠心脏,用2.5g /L 胰蛋白酶和2.0g /L 型胶原酶等量混合液在37条件下分次消化心肌组织。以差速贴壁并将时间延长至90min 纯化心肌细胞,文献标识码:A文章编号:1009-7236(201406-654-03网络出版地址:http :/wwwcnkinet /kcms /detail /61126820130925183

2、3006html 网络出版时间:2013-9-2518:33基金项目:国家自然科学基金项目资助(81070093;重庆市科技攻关计划项目资助(CSTC ,2011AC5031通讯作者:耿召华,副教授,主要从事ad 蛋白相关研究Email :gengzhhtomcom作者简介:胡保奎,硕士生Email :641117506qqcomCulture and identification of cardiomyocytes in neonatal ratsHU Bao-kui ,GENG Zhao-hua ,ZHU Shan-jun ,LIU Yu-feng(Department of Cardio

3、logy ,Xinqiao Hospital ,Third Military Medical University ,Chongqing 400037,China AbstractAIM :To develop a method of primary culture of neonatal rat cardiomyocytes with high survival肌细胞生长所需的营养,使之稳定生长,但原代心肌细胞一般易受外界条件因素的影响存活率往往较低。心肌细胞培养技术已广泛应用于心血管领域分子水平的研究,有助于从细胞和分子水平研究心血管系统疾病的发病机制和治疗方法1,2。本研究的目的在于建立

4、一种简单稳定、可靠的心肌细胞培养方法,以为心血管系统疾病的基础和临床研究奠定基础。1材料和方法11材料新生SD 大鼠由第三军医大学动物实验室提供。小牛血清和DMEM 培养基(Hyclone 公司,胰蛋白酶、型胶原酶、青霉素、磷酸盐缓冲液及5溴-25-溴脱氧核苷尿嘧啶(Brdu ,Sigma 公司,台盼蓝(Gibco 公司。IX70型倒置显微镜(Olympas 株式会社。·456·心脏杂志(Chin Heart J 2013,12方法121心肌细胞的体外培养1 2d的SD大鼠,每次取10 20只,无菌操作取出心脏并剪成1mm3组织块,以磷酸盐缓冲液洗1次,弃带血的上清液。用2

5、.5g/L胰蛋白酶和2.0g/L型胶原酶等量混合液在37条件下分次消化(每次10min,共7次,首次消化液弃去。收集细胞悬液,以1000g 离心10min,吸出上清液,加入含100ml/L小牛血清、100g/ml青霉素的DMEM培养液,吹打均匀后,经200目筛网过滤,于37、50ml/L CO2孵箱中差速贴壁90min。取上清液,细胞计数以1105个/ml的密度接种于6孔板中,加入0.1mmol/LBrdu抑制成纤维细胞生长,置37、50ml/L CO2孵箱中培养,48h后换液首次换液,以后隔天换液,培养7d。122心肌细胞的形态学观察取培养不同时间的心肌细胞,在倒置显微镜下用光镜观察心肌细胞

6、随着培养时间的不同其形态特征的变化。123心肌细胞的纯度鉴定在倒置显微镜下观察并计算差速贴壁纯化后的心肌细胞。心肌细胞的纯度以心肌细胞的阳性率(%表示,即心肌细胞数/(心肌细胞数+成纤维细胞数100%。124心肌细胞的存活率测定取培养第3天的心肌细胞悬液和4g/L台盼蓝溶液各100l并混匀。取少量细胞悬液滴在血球计数板,覆上盖玻片,其中呈蓝色的细胞为死亡细胞,未染色的细胞为活细胞。细胞存活率(%=(总心肌细胞数蓝染细胞数/总心肌细胞数100%。125心肌细胞的活力分析心肌细胞培养的第3天,在倒置显微镜下,6孔板中每孔任意选取5个视野,每个视野任选10个细胞,于低倍镜下计数搏动的细胞每分钟搏动次

7、数,计算心肌细胞平均搏动频率。2结果21心肌细胞的形态学观察心肌细胞消化后呈圆形,培养24h后基本贴壁生长,可见少数细胞开始搏动,节律不规则,搏动微弱,细胞呈梭形或多角形,核多为1个或两个,核仁清楚。培养48h后心肌细胞搏动增强,立体感明显,折光性强。培养3d 后,细胞伸出伪足交织成网,形成放射状排列的细胞簇(图1,呈同步性收缩,搏动细胞百分率约为80% 90%。图1培养3d的心肌细胞(200表1心肌细胞纯度的测定视野1000个细胞中心肌细胞(个阳性率(% 19359352948948391291249069065895895 23心肌细胞的存活率测定任选5孔,每孔任选1个视野,于低倍镜下计数

8、1000个细胞,计算心肌细胞的存活率(%,即平均存活率(%为(93.928%(表2。表2心肌细胞存活率培养孔1000个细胞中未染色的细胞(个存活率(% 19489482957957391591549049045970970 24心肌细胞的活力分析心肌细胞培养第3天,在倒置显微镜下观察心肌细胞的平均搏动率为80 130次/min,搏动同步,收缩有力。 3讨论心脏主要由心肌细胞和成纤维细胞组成,心肌细胞占心脏细胞总数的33%左右。成功地分离心肌细胞是体外培养的关键步骤,本实验采用2.5g/L 胰蛋白酶和2.0g/L型胶原酶等量混合液,消化时间明显缩短,胰蛋白酶可使细胞间的蛋白质水解,切断细胞间的连

9、接,使细胞脱落,但其也能消化细胞膜上的蛋白成分,心肌细胞比较脆弱,容易被损伤死亡。型胶原酶主要消化细胞间质中的胶原纤维,对心肌细胞损伤小,两者混合使用,既能减少对心肌细胞的损伤作用,又能提供消化效率,缩短消化时间。在常规消化的基础上,本实验进行分次消化,每次消化后,弃上清,加入含100ml/L小牛血清、100g/ml青霉素的DMEM培养液终止消化酶消化,避免酶液对细胞的持续损伤,对心肌细胞具有保护作用。第一管消化液中组织成分较多,应舍弃,可以明显提供心肌细胞的纯度。混合酶消化往往比单一酶消化能获得好的效果,发现胶原酶和DNA酶组合使用,能达到很好的消化效果3。在消化过程中,注意控制适宜的温度,

10、在37酶的活性较高,能获得很好的消化效果。每次消化时间应控制在10min以内,以避免长时间消化酶对细胞的损伤作用。避免产生气泡,因为气泡表面的张力作用可牵拉损伤细胞。用吸管反复吹打,使细胞脱落,可缩短消化时间。心肌细胞和成纤维细胞在培养板中的贴壁速度不同,成纤维细胞比心肌细胞更容易贴壁,采用差速贴壁可纯化心肌细胞,适当延长贴壁时间可提高心肌细胞分离的纯度。本实验将贴壁时间延长至90 min,获得高纯度的心肌细胞,同有关报道相一致4,5。但此种方法只适合短期培养,不适合细胞的长期培养。0.1mmol/L的Brdu可以抑制成纤维细胞,提高培养的心肌细胞纯度,因其浓度过高会抑制心肌细胞生长。本实验将

11、贴壁时间和加用Brdu 方法适当结合,获得了很好的结果。心肌细胞培养结果受多种因素的影响,一般乳鼠出生时间越短,细胞成活率越高,本实验选择1 2d内的乳鼠心肌细胞培养的成活率很高。培养过程中应严格无菌,尽量缩短操作时间,培养液的pH 值一般应控制在7.0 7.2之间,首次换液为48h 后,以后隔天换液。共换液6次,培养7天,总之,本实验通过改良后的培养方法,不仅操作简单,而且心肌细胞的纯度和存活率高,较以往方法不同的是,采用两种消化酶协同分次消化,消化完立即终止消化,避免一种消化酶长时间对细胞的损伤作用,培养周期长,可动态观察细胞生长形态变化,是一种较理想的心肌细胞原代培养方法。参考文献:1S

12、hkryl VM,Maxwell JT,Domeier TL,et alefractoriness of sarco-plasmic reticulum Ca2+release determines Ca2+alternans in atrial myocytesJAm J Physiol Heart Circ Physiol,2012,302(11: 231023202Marshall GE,ussell JA,Tellez JO,et alemodelling of humanatrial K+currents but not ion channel expression by chronic-blockadeJPfluger Arch,2012,463(4:5375483李博,吴慧颖,朴虎林,等新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良J中国实验诊断学,2012,16(2:2002034刘嘉祺,孙云云乳鼠心肌细胞原代培养方法J微量元素与健康研究,2012,29(4:465Bes S