桔梗细胞悬浮培养体系对斑蝥素的生物转化研究

1、化学成分桔梗细胞悬浮培养体系对斑蝥素的生物转化研究叶敏,戴均贵,果德安(北京大学药学院中医药现代研究中心,北京100083摘要:目的研究桔梗细胞悬浮培养体系对抗癌天然活性成分斑蝥素的生物转化,以获得具有新颖结构的斑蝥素衍生物。方法往桔梗悬浮培养体系中加入斑蝥素并培养6d,培养液经萃取后采用色谱方法进行分离纯化,产物的结构根据光谱数据予以鉴定。结果分离得到了以21比例混合存在的两个转化产物。经光谱分析,两个产物鉴定为羰基还原为羟基的一对差向异构体12羟基斑蝥素( a及12羟基斑蝥素( b。结论 a和 b均为未见报道的新化合物。桔梗细胞培养体系对斑蝥素具有较强的选择性还原作用,此转化反应可用于斑蝥

2、素衍生物的制备。关键词:斑蝥素;桔梗;细胞悬浮培养;生物转化中图分类号:R28411文献标识码:A文章编号:02532670(200310086903B iotran sforma tion of can thar id i n by cell suspen sion cultures of P la tycodon g rand if lorusYE M in,DA I Jun2gu i,GU O D e2an(Schoo l of Pharm aceu tical Sciences and M odern R esearch Cen ter fo r T raditi onal Ch in

3、eseM edicine,Pek ing U n iversity,Beijing100083,Ch inaAbstract:ObjectTo investigate the b i o tran sfo rm ati on of can tharidin by cell su sp en si on cu ltu res of P la ty cod on g rand if lorus(Jacq1A1DC1M ethodsCan tharidin w as added in to cell su sp en si on cu ltu res of P1g rand if lorus and

4、 incubated fo r ano ther six days1T he cu ltu re sup ernatan t w as ex tracted w ith E tOA c and then sub jected to silica gel ch rom atograp hy1ResultsTw o p roducts w ere iso lated as a m ix tu re in a m o lar rati o of abou t211T heir structu res w ere iden tified on the basis of sp ectro scop ic

5、 data as12O H can2 tharidin( aand12O H can tharidin( b1T he relative configu rati on w as elucidated acco rding to NO ESY sp ectrum1ConclusionT he tw o p roducts w ere new can tharidin derivatives1 Key words:can tharidin;P la ty cod on g rand if lorus(Jacq1A1DC1;cell su sp en si on cu ltu re;b i o t

6、ran s2 fo rm ati on斑蝥为芫青科昆虫南方大斑蝥M y labris p ha lera ta Pallas或黄黑小斑蝥M1cichorii L in2 naeu s的干燥体,属传统中药,早在神农本草经中就有记载。具有破血消、攻毒蚀疮等功效,中医临床用于治疗瘕肿块、积年顽癣等病症1。现代研究表明,斑蝥的主要有效成分为斑蝥素(can tharidin。该成分具有显著的抗肿瘤活性,对原发性肝癌、腹水型肝癌、S180实体瘤等均具有显著疗效,其机制主要是通过诱导细胞调亡2。与一般抗肿瘤药物不同的是,斑蝥素在抑制肿瘤的同时,还可促进骨髓产生白细胞3。因此,这类成分的深入研究对于发现新型抗

7、肿瘤药物具有重要意义。但是,临床观察表明斑蝥素对黏膜组织表现出强烈的毒性和刺激作用,尤其是胃肠道、尿道和肾脏4。这些不良反应严重影响了斑蝥素的临床应用。迄今,有机化学家已合成了大量的斑蝥素衍生物,以期发现更为安全有效的药物。此类研究主要是针对于斑蝥素结构中的桥头碳原子以及酸酐键的开裂57。遗憾的是,此类衍生物的抗肿瘤活性大多不太理想。生物转化是利用生物体系产生的酶对外源化合物进行的酶催化反应。由于通过生物转化往往能得到化学合成难以获得的新颖结构,此技术在天然产物及其他有机化合物的结构改造研究中已显得越来越重要8。斑蝥素的生物转化目前尚未见到报道。本968中草药Ch inese T raditi

8、 onal and H erbal D rugs第34卷第10期2003年10月收稿日期:2002212216基金项目:国家杰出青年基金(39925040;教育部跨世纪优秀人才基金(文采用桔梗细胞悬浮培养体系,对斑蝥素这一来源于动物的天然活性成分进行了生物转化研究。1材料与试剂111仪器与试剂:A vatar360型傅里叶红外光谱仪测定;B ruker DRX-500型核磁共振仪测定;M S为F inn igan M A T-90及B ruker B IFL EX 型质谱仪。柱色谱用硅胶(200300目购自青岛海洋化工厂。石油醚(6090,醋酸乙酯,丙酮均为分析纯,北京化工厂产品。112药品(

9、底物:斑蝥素购自中国药品生物制品检定所,用前以丙酮溶解,配成5m g mL的溶液。113细胞培养:桔梗细胞悬浮培养体系诱导自桔梗P la ty cod on g rand if lorus(Jacq1A1DC1的幼嫩叶和茎段。细胞体系的建立及培养参照文献9。所用培养基为M S培养基,另加015m g L NAA(2萘乙酸,015m g L62BA(62苄基腺嘌呤,012m g L2, 42D(2,42二氯苯氧乙酸及3%蔗糖。培养基于灭菌前调pH值为518。继代时往500mL三角瓶(盛200 mL培养基中接入约210g L细胞(干重,于黑暗条件下室温振荡培养,摇床转速为110r m in,每两周

10、继代一次。2实验方法211转化反应预试:往预培养4d的桔梗悬浮细胞(500mL中加入5m g mL斑蝥素丙酮溶液015 mL,继续培养6d后,用等体积醋酸乙酯萃取3次,萃取液合并,40减压浓缩至干,残渣以1mL丙酮溶解,作为样品溶液。取该溶液进行硅胶薄层色谱, TL C条件为石油醚2丙酮(41,展开后挥尽展开剂,置碘蒸汽中显色,斑蝥素与产物均呈淡黄色斑点。另设对照组,往桔梗悬细胞中加入等量丙酮,其余操作同前。212制备生物转化试验:往预培养4d的桔梗悬浮培养细胞中加入5m g mL斑蝥素丙酮溶液110 mL,共用4瓶细胞。同211所述,继续培养6d后用醋酸乙酯萃取,浓缩所得残渣以丙酮溶解,与少

11、量硅胶拌合,晾干。该样品行硅胶柱色谱(200300目, 10g,115c m×25c m,洗脱剂为石油醚2丙酮(41,分别得到无色细针状结晶 (3m g和 (8m g,得率40%。3结果与讨论在转化预试验中,样品液经TL C分析,用碘蒸汽显色,薄层板上在与斑蝥素相应的位置(R f0140及其下方(R f0125处均呈淡黄色斑点,而在对照组样品中则未见相应斑点,表明斑蝥素在桔梗悬浮培养体系中有转化反应发生。往桔梗悬浮培养体系中投入20m g斑蝥素,进行制备转化试验,细胞液经提取分离,得到3m g未转化的底物斑蝥素 ,以及8m g产物 。其结构根据光谱数据予以鉴定(图1 。图1桔梗细胞悬

12、浮培养体系对斑蝥素的生物转化反应F ig11B iotran sfor ma tion of can thar id i n by cellsuspen sion culture of P1g rand if lorus图2化合物 b的主要NOE增益关系F ig12Key NOEcorrela-tion s forco m poundbTO F2M S显示其M+H+峰为19911m z,表明 的相对分子质量为198,比斑蝥素大2。其1H2NM R与13C2NM R谱中信号均以大约21的比例成对出现,提示 为摩尔比为21的一对异构体混合物,二者结构非常相似,其中量大者为 a,量小者为 b。1H2

13、NM R谱中, a和 b均呈现出二个甲基氢信号,表明其结构已失去了斑蝥素的对称性。在13C2NM R谱中, a, b均仅见一个酯羰基信号,而分别在10514和10312出现两个饱和叔碳信号。根据H SQ C 谱,其对应的氢信号分别为5137(1H,s和5161 (1H,s,可推断此为同时与两个氧原子相连的碳。据此,可确定 a和 b为羰基还原为羟基的斑蝥素衍生物,二者结构的差别仅在于羟基的构型不同。根据NO ESY谱, b的H21信号(5161与H27 (4136有NO E增益,表明H21处于构型,即 b 为12O H衍生物,则 a为12O H衍生物(图2。 a中H21(5137与82CH3(1

14、109之间的NO E增益亦证明其H21处于构型。据以上推导, a的结构鉴定为12羟基斑蝥素(12O H can tharidin, b 为12羟基斑蝥素(12O H can tharidin,二者均为新化合物,其1H2NM R,13C2NM R信号根据D EPT, H SQ C及HM BC谱予以归属10。a:1H2NM R(500M H z,CDC l3,:5137(1H, s,H21,4173(1H,d,J=415H z,H27,4158(1H,d, J=415H z,H24,116118(4H,m,H25,H26, 1113(3H,s,92CH3,1109(3H,s,82CH3;13C2N

15、M R (125M H z,CDC l3,:17919(s,C23,10514(d,C278中草药Ch inese T raditi onal and H erbal D rugs第34卷第10期2003年10月1,8312(d ,C 24,8211(d ,C 27,5411(s ,C 27a ,5214(s ,C 23a ,2412(t ,C 26,2215(t ,C 25,1514(q ,C 28,1415(q ,C 29。b :1H 2NM R (500M H z ,CDC l 3,:5161(1H ,s ,H 21,4151(1H ,d ,J =510H z ,H 24,4136(1H

16、 ,d ,J =510H z ,H 27,116118(4H ,m ,H 25,H 26,1114(3H ,s ,92CH 3,1101(3H ,s ,82CH 3;13C 2NM R (125M H z ,CDC l 3,:17919(s ,C 23,10312(d ,C 21,8615(d ,C 27,8415(d ,C 24,5512(s ,C 27a ,5212(s ,C 23a ,2411(t ,C 25,2315(t ,C 26,1311(q ,C 29,1112(q ,C 28;E I 2M S (m z ,rel 1in t 1:169(711,153(415,112(6213

17、,96(10010;TO F 2M S (m z :19911M +H +。图3化合物 的化学结构式F ig 13Che m ica lstructure of co m -pound a 及 b 结构中的12O H 属半缩醛羟基,性质活泼,在溶液状态下易发生翻转,故二者以混合物的形式存在,难以分离。M cC lu skey 曾用Pd C 加氢还原的方法,以去甲斑蝥素为底物制备得到类似的加氢产物 ,亦为一混合物(图33。抗肿瘤试验结果表明, 对于大肠癌细胞株表现出显著的选择性细胞毒活性,提示加氢反应对于斑蝥素类似物的抗肿瘤作用具有一定的意义。本实验中得到的产物尚有待作抗肿瘤活性测试。作者曾尝试

18、桔梗、长春花、连翘等多种植物细胞悬浮培养体系,结果表明桔梗体系对斑蝥素的转化比较完全。Gao 等报道了酵母菌对酮基的加氢还原反应11,本文则采用桔梗细胞悬浮培养体系得到了类似结果,提示这些生物体系中存在相似的还原酶。References :1Ch P (中国药典J 12000ed 1V o l 12J in W ,W ang Y W ,Zhou Z X ,et al 1T he effects of can 2tharidin on HL 260and Q GY 7703cell lines J 1A cta Ch in M ed P har m acol (中医药学报,2001,29(4:4

19、224313M cC luskey A ,Bow yer M C ,Co llins E ,et al 1A nhydridemodified cantharidin analogues :synthesis ,inh ibiti on of p ro 2tein pho sphatases 1and 2A and anticancer activity J 1B ioorg M ed Che m L ett ,2000,10:16872169014W ang C C ,W u C H ,H sieh K J ,et al 1Cyto toxic effects ofcantharidin o

20、n the grow th of no rm al and carcinom a cells J 1T ox icology ,2000,147:7728715M cC luskey A ,Keane M A ,M udgee L M ,et al 1A nhydridemodified cantharidin analogues 1Is ring opening i m po rtant in the inh ibiti on of p ro tein pho sphatase 2A ?J 1E u r J M edChe m ,2000,35:957296416M cC luskey A

21、,W alkom C,Bow yer M C,et al 1Canthari m 2ides :new class of modified cantharidin analogues inh ibiting p ro tein pho sphatases 1and 2A J 1B ioorg M ed Che m L ett ,2001,11:29412294617E ssers M ,W ibbeling B ,H aufe G 1Synthesis of the first fluo 2rinated cantharidin analogues J 1T etrahed ron L ett

22、 ,2001,42:54292543318L ough lin W A 1B i o transfo rm ati on in o rganic synthesis J 1B ioresou rce T echnol ,2000,74:4926219D ai J G ,Gong Z ,Zhu D M ,et al 1B i o transfo rm ati on of gas 2trodin by Catharanthus roseus J 1A cta B ot S in (植物学报,2002,44(3:3772378110Chen D C 1H and book f or CM M Che m ical R ef erence S ub 2stances (中药化学对照品工作手册M 1Beijing :Ch inaM edico 2Pharm acentical Science and T echno logy Publish ing House ,2002111Gao X ,Zhou G ,Guan Y K ,et al 1Bakers yeast m ediated re 2ducti on of op tically active diketone J 1C