抗凋亡因子Survivin在肾性高血压心肌中的表达

1、抗凋亡因子Survivin在肾性高血压心肌中的表达         11-06-01 08:31:00     作者：吴瑞霞 张端莲    编辑：studa20【摘要】  目的：探讨L精氨酸对肾性高血压心肌保护的作用机制。方法:将大鼠随机分为3组：正常对照组(5只)、高血压对照组(20只)及L精氨酸治疗组(20只), 制作肾性高血压动物模型， L精氨酸治疗组通过胃管灌饲给予L精氨酸，连续给药8周后，切取各组心室肌组织,进行免疫

2、组织化学染色,观察各组心肌组织Survivin的表达。利用HPIAS2000图像分析系统测定Survivin在各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：Survivin在LArg组的表达显著高于高血压对照组。图像分析结果显示Survivin在两组间差异有显著性意义(P<0.01)。结论：L精氨酸对肾性高血压导致的心肌细胞损伤具有重要的保护作用。 【关键词】  L精氨酸; Survivin; 心肌; 免疫组织化学心血管疾病是当前威胁人类健康的头号杀手,心肌肥大是心脏病的独立危险因素,其详细机制尚不完全清楚。肾性高血压是继发于肾脏病的高血压,在原有疾病损害的基础上,血压升高会加

3、重对心脏的损害1。一氧化氮(nitric oxide, NO)是近年来发现的一种主要由内皮细胞等合成,释放的小分子生物活性介质,广泛参与机体多种病理生理过程。研究发现,作为体内NO合成的唯一底物Larg在多种组织或器官I/R损伤中发挥重要的保护作用2。深入研究LArg这一具有潜在重要前景的一氧化氮前体在治疗肺动脉高压中的作用与机制是当今该领域的重要课题。近年研究证实L精氨酸是一种新型抗高血压药物,但其作用机制尚不清楚。survivin 是新近发现的一种结构独特的哺乳类凋亡抑制蛋白( inhibition apoptosis protein , IAP ),表达于人与鼠的胚胎发育组织和人类大多数

4、肿瘤组织, 但在正常成人组织不表达( 胸腺除外) 3，其与肿瘤发生、发展有关。survivin 还参与细胞周期调控4。我们应用免疫组织化学方法观察了L精氨酸对肾性高血压心肌组织中survivin的表达,并采用图像分析系统测定survivin表达的平均光密度和平均阳性面积率。探讨L精氨酸治疗由肾性高血压导致的心肌细胞的损害，为临床上采用L精氨酸治疗肾性高血压提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料1.2 方法按体重将大鼠随机分为3组：正常对照组(5只)、肾性高血压组(20只)和L精氨酸治疗组(20只)。肾性高血压组和L精氨酸治疗组大鼠用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30mg/kg)，然后动物取右侧

5、卧位,暴露左肾区,在左肋弓下旁开脊柱0.5cm处作一切口,入腹腔探出左肾,分离左肾动脉,上一内径为0.20mm银夹,以部分缩窄左肾动脉。右侧肾脏不触及。然后,关闭创口,让大鼠苏醒。术前血压以100140mmHg(1mmHg=0.1333kPa)为正常范围,术后血压超过140mmHg时,即确定动物高血压形成,并用于药物实验。对那些已放置银夹,但在术后第4周末血压仍未升高的大鼠,将在给药前从药物实验中剔除。LArg组于术后第5周开始每天给予L精氨酸200mg/kg;将L精氨酸溶于蒸馏水中通过胃管灌饲给药,连续给药8周。正常对照组给予同等容积的溶剂。在给药时间结束之时,再次测量动物体重和血压。8周后

6、将各组大鼠处死,切取心室肌组织,进行免疫组织化学实验观察。2.2 主要试剂 浓缩型兔抗鼠survivin单克隆抗体(北京中杉生物技术有限公司); 超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒(北京中杉生物技术有限公司); 显色试盒及多聚赖氨酸(北京中杉生物技术有限公司)。2.3 免疫组织化学SP法检测survivin相关抗原主要步骤： 组织切片5 m，常规脱蜡至水，蒸馏水洗; 3%过氧化氢，37孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min; survivin采用微波抗原修复(3档，10 min)， PBS洗4×5min; 正常羊血清37孵育10 min以减少非

7、特异性反应; 一抗37孵育1h，PBS洗4×5min; 生物素标记的二抗，37孵育10 min，PBS洗4×5min; 链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物37孵育10 min，PBS洗4×5min; DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应; 苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。2.4 免疫组织化学结果判断survivin以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞浆内无棕黄色反应物。采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对survivin的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。2.5 统计学处理对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNKq检验，检验水准为0.05。2 结果正常对照组心肌细胞胞浆内可见密集分布的棕黄色颗粒survivin呈阳性表达;肾性高血压组心肌细胞胞浆内棕黄色颗粒较少，survivin表达弱;L精氨酸治疗组心肌细胞胞浆内可见较多