柱前衍生HPLC分析铁皮石斛多糖中单糖组成的变异规律

1、 柱前衍生HPLC 分析铁皮石斛多糖中单糖组成的变异规律苑鹤1,白燕冰2,斯金平1*,张爱莲1,金小丽1(1.浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地天然药物研究开发中心,浙江临安311300;2.云南省德宏热带作物研究所,云南瑞丽678600摘要通过采集铁皮石斛不同种质、年龄及近缘种的药材,采用柱前衍生HPLC 法测定多糖中的单糖组成。结果表明,铁皮石斛与近缘种间,铁皮石斛种质与年龄间各种单糖的绝对量和相对量均存在显著的差异,其中甘露糖绝对峰面积,铁皮石斛近缘种间变幅为0.854107 10.340107,铁皮石斛种内为1.467107 8.475107,一至三年生样品分别为4.41

2、1107(2.577107 6.516107,5.528107(3.179107 8.475107,3.601107(1.467107 5.888107;甘露糖与葡萄糖比值(相对峰面积,铁皮石斛近缘种间为0.976 16.599,种内为2.6797.831,在供试样品中只有肿节石斛、报春石斛的相对峰面积与铁皮石斛重叠。研究结果揭示了铁皮石斛多糖中的单糖组成的变异规律,通过品种选育、采收期的控制可改变铁皮石斛中单糖的组分;利用铁皮石斛甘露糖与葡萄糖的相对峰面积可排除多数铁皮石斛混淆品,为铁皮石斛质量控制、资源培育提供依据。关键词铁皮石斛;柱前衍生法;HPLC ;单糖稿件编号20110425005

3、基金项目浙江省重大科技专项项目(2009C12059通信作者*斯金平,Tel :138*,E-mail :lssjp 铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo 是我国传统名贵中药材,具有益胃生津、滋阴清热等功效,多糖是其主要活性成分1-2,总多糖含量的高低是目前铁皮石斛质量评价的主要指标。但作者在研究过程中发现,紫皮石斛及一些其他石斛多糖质量分数也很高,甚至超过铁皮石斛,因此,用总多糖来衡量铁皮石斛真伪与优劣显然不够全面。多糖中单糖的组成测定是目前探索多糖质量标准,研究多糖结构、性质及构效关系等基本信息的重要手段。柱前衍生化HPLC 测定单糖含量的方法具

4、有灵敏、快速、准确、方便和可在线大批量分析的诸多优点3,为此,本文采用该法,着重研究了铁皮石斛及近缘种、种质与年龄对铁皮石斛多糖中的单糖组成的影响,为铁皮石斛质量控制、资源培育提供依据。1材料1.1仪器与试剂Waters 1525高效液相色谱仪:1525泵,2487双波长紫外检测器,7725型手动进样器,Breeze 3.0版的色谱工作站(美国Waters 公司;SWB5200型超声清洗机(上海必能信超声有限公司;Milli-Q 超纯水仪(美国Millipore 公司,机型为Milli-Q Academic ;pH 计(Thermo 公司;FA1104分析天平(上海天平仪器厂。甘露糖、鼠李糖、

5、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖对照品(批号分别为140651-200602,111683-200401,111646-200301,110833-200503,0226-9602,1508-200001,1506-200203全部购于中国药品生物制品检定所;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP 为化学纯,购于国药集团化学试剂有限公司;三氟乙酸(TFA 为分析纯,购于成都科龙化工试剂厂;乙腈为色谱纯,水为去离子水,其他试剂均为分析纯。1.2供试药材供试药材共44个样品,其中133号样品,2008年11月至2009年3月采自浙江建德、武义、庆元、义乌、天台、临安、湖州、桐庐等铁皮石

6、斛设施栽培骨干基地,包括11个种质一至三年生(生理年龄样品,经斯金平教授鉴定为铁皮石斛D .officinale 2;34 44号样品,2009年11月采自云南省德宏,经白燕冰研究员鉴定,分别为铁皮石斛、长苏石斛D .brymerianum 、鼓槌石斛D .chryso-toxum 、球花石斛D .thyrsiflorum 、兜唇石斛D .aphyl-lum、报春石斛D.primulinum,见表1,采样要求与文献2一致。方法学研究药材为31号样品。表1不同种质铁皮石斛与近缘种石斛药材样品信息 2方法铁皮石斛总多糖质量分数采用苯酚-硫酸法,详见文献2;铁皮石斛多糖中的单糖组成采用柱前衍生HPL

7、C法测定,详见文献6。3结果与分析3.1石斛多糖部位指纹图谱的建立对照品混合溶液及样品衍生物HPLC色谱图见图1,2。比较44个石斛样品多糖部位的色谱图,确定6个峰作为石斛多糖部位指纹图谱的特征峰。通过与对照品衍生物HPLC图的比对,6个主要色谱峰分别为1甘露糖、3半乳糖醛酸、4葡萄糖、5半乳糖、6木糖、7阿拉伯糖,见图2。1.甘露糖;2.鼠李糖;3.半乳糖醛酸;4.葡萄糖;5.半乳糖;6.木糖;7.阿拉伯糖。图1对照品衍生物HPLC图3.2铁皮石斛近缘种间及铁皮石斛种质之间多糖中单糖组成的差异铁皮石斛近缘种间及铁皮石斛不同种质(一至三年生平均值多糖中各单糖绝对峰面积见表2。供试样品多糖中的各

8、种单糖的绝对量在物种间及铁皮石斛不同种质间均存在显著的差异,种间的差异明显大于种内差异。甘露糖是石斛A.铁皮石斛;B.肿节石斛;C.球花石斛;D.鼓槌石斛;1.甘露糖;3.半乳糖醛酸;4.葡萄糖;5.半乳糖;6.木糖;7.阿拉伯糖。图2部分石斛样品多糖部位HPLC指纹图谱对峰面积范围为0.854107 10.340107,其中长苏石斛最低,为0.854107,齿瓣石斛最高,为10.340107,两者相差11.11倍。铁皮石斛不同种质间甘露糖绝对峰面积 范围为2.5821076.429107,其中铁皮石斛种质资源最低,为2.582107,铁皮石斛A最高,为6.429107,两者相差2.49倍。因

9、此,通过品种选育可以改变铁皮石斛中单糖的组分,提高铁皮石斛中多糖及甘露糖的含量2。在指纹图谱中一般选择含量较高且稳定的峰作为参照峰,上述单糖中,葡萄糖选择含量较高且稳定,因此选择葡萄糖为参照峰,计算相对峰面积,见表3。供试样品中各种单糖的相对量在铁皮石斛近缘种间及铁皮石斛种质间也存在显著的差异,铁皮石斛近缘种间甘露糖相对峰面积变幅为0.97616.599,半乳糖醛酸为0.012 0.162,半乳糖为0.012 0.091,木糖为0.005 0.116,阿拉伯糖为表2石斛及不同种质铁皮石斛中各种单糖绝对峰面积物种资源总多糖/mg·g1各种单糖绝对峰面积甘露糖/107半乳糖醛酸/105葡

10、萄糖/107半乳糖/105木糖/105阿拉伯糖/105注:表中部分总多糖数据引自文献2。表3石斛及不同种质铁皮石斛中各种单糖相对峰面积物种资源各种单糖相对峰面积甘露糖半乳糖醛酸葡萄糖半乳糖木糖阿拉伯糖 比值变幅为2.964 6.413,半乳糖醛酸为0.017 0.104,半乳糖为0.012 0.091,木糖为0.005 0.116,阿拉伯糖为0.007 0.110;其中甘露糖相对峰面积贡献最大,近缘种间差异明显,种内差异相对小,在供试样品中甘露糖与葡萄糖比值与铁皮石斛重叠的只有肿节石斛;半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、阿拉伯糖的相对峰面积贡献较小,铁皮石斛与近缘种间差异小,甚至完全重叠。因此,甘露糖

11、与葡萄糖的峰面积比值可基本排除铁皮石斛的混淆品。3.3不同生理年龄铁皮石斛多糖中单糖组成的差异不同生理年龄铁皮石斛多糖中的各种单糖绝对峰面积见表4。不同生理年龄铁皮石斛多糖中的各种单糖绝对峰面积均存在显著的差异。甘露糖的峰面积一至三年生分别为4.411107(2.577107 6.516107,5.528107(3.179107 8.475107,3.601107(1.467107 5.888107,二年生最高,三年生最低,二年生比三年生高54%;半乳糖醛酸的峰面积一至三年生分别为4.336105 (0.548105 19.420105,3.923105(0.745105 7.225105,1

12、.146105(0.494105 1.833105,随着年龄增加而降低,一年生比三年生高277%;葡萄糖的峰面积一至三年生分别为0.800107(0.440107 1.581107,1.264107 (0.521107 1.951107,0.734107(0.281107 1.094107,二年生最高,三年生最低,二年生比三年生高72%;半乳糖的峰面积一至三年生分别为4.149105(1.185105 8.593105, 3.871105(1.551105 5.906105,2.155105 (0.165105 5.329105,随着年龄增加而降低,一年生比三年生高92%;木糖的峰面积一至三年

13、生分别为1.059105(0.242105 2.630105, 1.284105(0.410105 2.060105,0.507105 (0.148105 1.031105,二年生最高,三年生最低,二年生比三年生高151%。阿拉伯糖的峰面积一至三年生分别为2.806105(0.702105 13.861105,3.210105(0.930105 5.383105,0.622105(0.186105 1.140105,二年生最高,三年生最低,二年生比三年生高418%。上述结果可能与铁皮石斛的生物特性相关,一年生(生理年龄的铁皮石斛叶片生长旺盛,光合作用为植株合成大量能量,且没有开花等的消耗,单糖

14、得到积累;第2年叶片开始脱落,虽伴随着开花与呼吸消耗,但叶片的光合作用仍能为植株积累能量,但半乳糖醛酸和半乳糖可能转化为其他单糖或被开花与呼吸消耗;第3年叶片全部脱落并随着开花与呼吸等消耗,各种单糖均明显下降。因此,根据铁皮石斛中多糖与单糖的变异规律,采收应在三年生开花前进行。表4不同生理年龄铁皮石斛各种单糖绝对峰面积生理年龄样品号总多糖/mg·g1各种单糖绝对峰面积甘露糖/107半乳糖醛酸/105葡萄糖/107半乳糖/105木糖/105阿拉伯糖/105 续表4生理年龄样品号总多糖/mg·g1各种单糖绝对峰面积甘露糖/107半乳糖醛酸/105葡萄糖/107半乳糖/105木糖

15、/105阿拉伯糖/105不同生理年龄铁皮石斛多糖中的各种单糖相对峰面积见表5。生理年龄也显著地影响铁皮石斛多糖中的各种单糖相对峰面积,其中对总峰面积贡献最大的甘露糖相对峰面积,在种质与生理年龄的共同影响下变幅为2.679 7.831。表5不同生理年龄铁皮石斛各种单糖相对峰面积生理年龄样品号各种单糖相对峰面积甘露糖半乳糖醛酸葡萄糖半乳糖木糖阿拉伯糖 第 36 卷第 18 期 2011 年 9 月 Vol. 36，Issue 18 September， 2011 续表 5 生理 年龄 样品号 铁皮石斛 21 铁皮石斛 24 铁皮石斛 27 铁皮石斛 30 铁皮石斛 33 各种单糖相对峰面积 甘露糖

16、 5. 823 6. 245 4. 956 7. 275 7. 215 半乳糖醛酸 0. 013 0. 007 0. 017 0. 032 0. 020 葡萄糖 1 1 1 1 1 半乳糖 0. 013 0. 042 0. 013 0. 010 0. 006 木糖 0. 006 0. 010 0. 010 0. 015 0. 006 阿拉伯糖 0. 005 0. 003 0. 008 0. 019 0. 004 4 结论与讨论 铁皮石斛与近缘种间， 铁皮石斛不同种质与年 供试样品中只有肿节石斛、 报春石斛的相对峰面积 与铁皮石斛重叠。因此， 通过品种选育、 采收期的控 制可改变铁皮石斛中单糖的

17、组分， 利用铁皮石斛甘 露糖与葡萄糖的相对峰面积可排除多数铁皮石斛混 淆品。 参考文献 1 中国药典 . 一部 . 2010： 265. S 2 诸燕， 斯金平， 郭宝林， . 人工栽培铁皮石斛多糖质量分数 等 . 2010， 4） ： 427. 35（ 变异规律J 中国中药杂志， 3 王静，王 晴，向 文胜 . 色谱法在糖类化合物分析中的应用 J 分析化学， 2001， 2） ： 222. 29（ 4 金小丽， 苑鹤， 斯金平， . 开花对铁皮石斛多糖质量分数及 等 J 2011， 16） ： 2176. 36（ 单糖组成的影响 . 中国中药杂志， 龄间各种单糖的绝对量和相对量均存在显著的差

18、 异。其中， 总峰面积贡献最大的甘露糖， 绝对峰面积 近缘种间变幅为 0. 854 × 10 10. 340 × 10 ， 铁皮石 7 7 斛种质间为 1. 467 × 10 8. 475 × 10 ， 种间的差异 大 于 种 内； 铁 皮 石 斛 一 至 三 年 生 样 品 分 别 为 4. 411 × 10 7 （ 2. 577 × 10 7 6. 516 × 10 7 ） ， 528 × 10 7 5. （ 3. 179 × 10 7 8. 475 × 10 7 ） ， 601 ×

19、; 10 7 （ 1. 467 × 3. 10 7 5. 888 × 10 7 ） ， 二年生比三年生高 54% 。 甘露 糖与 葡 萄 糖 比 值 （ 相 对 峰 面 积 ） ， 缘 种 间 为 近 0. 976 16. 599， 铁皮石斛种内为 2. 679 7. 831， 在 7 7 Variation of monosacchride composition of polysacchrides in Dendrobium officinale by precolumn derivatization HPLC method YUAN He1 ，BAI Yanbing2

20、 ，SI Jinping1* ，ZHANG Ailian1 ，JIN Xiaoli1 （ 1. A Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Research and Development Center for Natural Medicine，Zhejiang Agricultural and Forestry University，Lin'an 311300，China； 2. Dehong Institute of Tropical Agriculture in Yunn

21、an Province，Ruili 678600，China） Abstract The monosacchride composition of polysacchrides in Dendrobium officinal of different germplasms，physiological ages and closely related species were determined by precolumn derivatization HPLC. The results showed that the absolute and relative volumes of all m

22、onosacchrides were significantly different between D. officinale and its closely related species，different germplasms and physiological ages of D. officinale. Absolute peak areas of mannose ranged from 0. 854 × 10 7 to 10. 340 × 10 7 in closely related species of D. officinale，ranged from

23、1. 467 × 10 7 to 8. 475 × 10 7 in different germplasms of D. officinale and were 4. 411 × 10 7 （ 2. 577 × 6. 5. 8. 5. 10 7 - 516 × 10 7 ） ， 528 × 10 7 （ 3. 179 × 10 7 - 475 × 10 7 ） and 3. 601 × 10 7 （ 1. 467 × 10 7 - 888 × 10 7 ） ，respectively，in one to three physiological ages of D. officinale. The ratio of mannose to glucose peak areas （ relative peak area） ranged from 0. 976 to 16. 599 in closely related