枫叶黄酮对老年痴呆动物模型的抗氧化作用及分子机制

1、    枫叶黄酮对老年痴呆动物模型的抗氧化作用及分子机制李志安1，郭家智2，刘承杏2，李兴国2，傅希玥2，艾青龙1，孙 俊2*，陆 地2*(昆明医学院：1.附属第一院神经内科，昆明650032;2.人体解剖学教研室，昆明650031)摘要 目的：构建淀粉样蛋白1-42(A1-42)联合D-半乳糖(D-gal)致痴呆模型，探讨枫叶黄酮抗氧化的分子机制。方法：36只成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠随机分为3组：假手术组、模型组、治疗组。采用侧脑室注射淀粉样蛋白1-42(A1-42)联合腹腔注射D半乳糖(D-gal)构建SD大鼠衰老模型后经枫叶

2、黄酮治疗，采用Morris 水迷宫实验(MWM)检测大鼠学习记忆能力;用化学比色法检测大脑皮质丙二醛(MDA)和内源性巯醇抗氧化物(酶)：谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GR)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)、谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)含量;免疫印迹法检测大脑皮质中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族相关蛋白：细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular sig

3、nal-regulated protein kinase，ERK)、p38、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的磷酸化水平。结果：模型组与假手术组比较：逃避潜伏期明显延长(P<0.05)，在第象限逗留的时间明显减少(P<0.05)，跨越平台次数明显减少(P<0.05);大脑皮质MDA含量增加(P<0.05)，GR、GSH-PX的含量降低(P<0.05);p38、JNK磷酸化增强，ERK磷酸化水平降低。而枫叶黄酮治疗后：大鼠逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)，在第象限逗留的时间明显增加(P<0.05)，跨越平

4、台次数明显增加(P<0.05);大脑皮质MDA含量降低(P<0.05)，GR、GSH-PX 的含量升高(P<0.05);p38、JNK磷酸化被抑制，ERK的磷酸化增加。结论：枫叶黄酮能改善学习记忆能力，对抗大鼠神经系统衰老。其作用机制可能是通过上调衰老模型大鼠大脑皮质内源性巯醇抗氧化物(酶)GR和GSH-PX的含量，抑制p38、JNK磷酸化并增强ERK磷酸化。关键词 枫叶黄酮;淀粉样蛋白1-42;D-半乳糖;老年痴呆;巯醇抗氧化物(酶);大鼠Abstract Objective:To explore the anti-oxidative molecular mechanism

5、 of the flavonoid, the A1-42 plus D-galactose induced AD rat model was established. Methods: The 36 male SD rats were randomly divided into three groups: sham group, model group and treatment group. AD rat models were established by lateral ventricle injection of A1-42 and abdominal cavity injection

6、 of D-Galactose. Meantime, the rats were treated by intragastric administration of the flavonoid. The spatial learning and memory capacity of experimental rats was examined by the Morris water maze (MWM). The concentration of the MDA and endogenous thiol antioxidants (including GR, GSH, GSH-PX, SOD)

7、, were examined by colorimetric method in the cerebral cortex. The concentration of the ERK, p38 and JNK, p-ERK, p- p38, p-JNK were examined by western blotting methods. Results: The model group compared with control group: exhibited a significant increase in escape latencies (P<0.05), while a de

8、crease in the time of staying at the third quadrants of platform and the number of crossing over a platform; The concentration of the MDA was increased(P<0.05), while the concentration of the GR, GSH-PX were decreased in cerebral cortex (P<0.05); The expression of p-p38, p-JNK were increased,

9、while the expression of p-ERK was decreased (P<0.05). After treatment of the Flavonoid, the AD model rats exhibited a significant decrease in escape latencies (P<0.05), an increase in the time of staying the third quadrants of platform (P<0.05), and the number of crossing over a platform co

10、mpared with the model group(P<0.05). The concentration of the MDA was decreased, while the concentration of GR, GSH-PX were increased (P<0.05). The expression of the p-p38, p-JNK were decreased, while p-ERK was increased (P<0.05). Conclusion: The Flavonoid could improve the spatial learning

11、 and memory capacity and prevent the aging of central nervous systems in AD model rats by up-regulating the expression of the endogenous thiol antioxidants (including GR and GSH-PX) and p-ERK, down-regulating the expression of the p-p38 and p-JNK.Key words flavonoid;A1-42;D-galactose;Alzheimer's

12、 disease;thiol antioxidants;rat阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD) 又称老年性痴呆，是一种老年性中枢神经系统退行性疾病，随着我国人口逐年老化，其发病率也在不断上升，已有310万人患有AD，老年患者表现为记忆力进行性减退，并伴有不同程度的认知、语言和人格障碍，生活无法自理，给家庭和社会造成了巨大的经济负担，已成为全世界当前迫在眉睫必须解决的社会问题1。但目前AD仍缺乏有效的防治药物，其发病机制尚不清楚，众多研究者根据不同的学说采用不同的动物模型来研究AD的发病机制，其中以侧脑室或海马注射淀粉样蛋白(amyloid beta peptide，A

13、)，或腹腔注射D-半乳糖(D-galactose，D-gal)致衰老模型最为广泛，而侧脑室注射-淀粉样蛋白1-42(-amyloid peptide1-42， A1-42)联合腹腔注射D-半乳糖(D-galactose，D-gal)致衰老模型，报道较少。而氧化应激(oxidative stress)和凋亡在衰老中的作用越来越受到人们的重视，特别是近年来，有研究发现银杏提取物中的黄酮类物质如柚皮苷等具有清除自由基、抗氧化、抑制中枢神经细胞凋亡等药理作用，从而发挥抗衰老和神经保护作用 2。元宝枫(Acer truncatum Bunge)为槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer)落叶乔木，枫

14、叶黄酮为3，5，7，3，4-五羟基黄酮，即槲皮素3。尽管对银杏黄酮的抗衰老作用已有较好的认识4-6，但元宝枫叶黄酮是否有类似的抗衰老作用、其作用机制如何，未见系统研究报道。本实验拟通过A1-42联合D-gal构建痴呆大鼠模型，应用Morris水迷宫实验、化学比色法、免疫印迹法来检测枫叶黄酮对学习记忆能力的影响，对模型大鼠大脑皮质内源性巯醇抗氧化物(酶)：谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GR)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)、超氧化物歧化酶(superoxide dismuta

15、se，SOD)的影响和信号通路丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族相关细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)、p38、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的调控作用，探讨枫叶黄酮的抗氧化作用及其分子机制。材料和方法1 材料清洁级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠36只，(250±20)g，购自昆明医学院实验动物中心，动物生产许可证号：SCKK(滇)2005-0008。随机分为3组：即

16、假手术组(sham)、模型组(AD)、治疗组(treatment)，每组12只，自由饮水进食，12 h昼夜规律，适应性喂养1周后开始实验。假手术组：每日腹腔注射0.9%Nacl(4ml/kg)，第5周末右侧侧脑室内注射NS 5 l;模型组：每日腹腔注射D-gal(60 mg/kg，武汉杰辉生物技术有限公司，批号：20050902)，第5周末右侧侧脑室内注射A1-42(北京博奥森生物有限公司)10g (2 g/L);治疗组：腹腔内及右侧脑室内注射同B组，造模第1天即开始灌胃枫叶黄酮(纯度98%，昆明制药厂，75 mg/kg，0.9%Nacl配制)。各组给药均为1次/d，连续8周。为使假手术组和A

17、D模型组大鼠受到同样的灌胃刺激，均以等体积0.9%Nacl灌胃。实验全程右侧侧脑室内注射A1-42溶液一次：(将进入实验第42 d的成年雄性SD大鼠以3.6%水合氯醛(按10ml/kg)腹腔内注射麻醉，固定于DT- 2型脑立体定位仪上，暴露颅骨，侧脑室注射点参照包新明等著大鼠脑立体定向图谱7，前囟后1.3 mm，中线右侧旁开2.0 mm，向下进针4 mm，在颅骨上用牙钻打孔(钻薄颅骨而不钻透)，由微量进样器稍用力即透颅骨，缓慢注射A1-42 10 g (2g/L)，在5 min内注完，并留针5 min。2 方法2.1大鼠学习与记忆行为测试 于灌注治疗56 d后，采用Morris水迷宫(morr

18、is water maze，MWM)测试法8，包括Morris水迷宫，电脑摄像系统，配套软件分析系统(由昆明医学院云南省国际标准化大鼠行为学实验室提供)，进行定位航行试验和空间探索试验。定位航行实验(place navigation)：共进行5 d，每天晚上进行训练，每只训练4次。将大鼠面向池壁由4个入水点放入池中，测其120 s内成功进驻平台(平台置于第象限，大鼠找到平台并滞留其上5 s为成功进驻)所需时间(即逃避潜伏期，escape latency)。如在120 s内大鼠不能成功进驻平台，则实验者将其引上平台并令其停留10 s，记录逃避潜伏期为120 s，每次训练间隔时间为240 s。空间

19、探索试验(spacial probe test)：MWM实验最后1 d，撤除平台，从原平台象限对侧池壁中点将大鼠放入水中，记录1 min内大鼠在原平台象限的游泳时间和游泳轨迹，计算大鼠跨跃平台次数及各象限游泳时间。2.2脑组织匀浆MDA、GR 、GSH、GSH-PX、SOD测定 MWM测试后，立即每组随机抽出6只大鼠麻醉，冰0.9%Nacl灌注，快速断头，取出全脑，分离大鼠大脑皮质，称重，用0.9%Nacl制成10%的组织匀浆，离心，取上清液加入考马斯亮蓝G250，染料与蛋白质中NH3+基团结合，使溶液变为蓝色，测定吸光度值计算出组织匀浆中蛋白含量(考马斯亮蓝法)，然后加入GSH、GR、SOD

20、和GPX试剂盒(建成生物，南京)中的试剂，显色，使用可见光分光光度计来检测大鼠大脑海马内源性巯醇抗氧化物(酶)含量(比色法)。MWM测试后，立即每组抽出剩余的6 只大鼠，冰0.9%Nacl灌注，取出大脑，分离大脑皮质，进行蛋白质样品的制备：按10ml/g的比例加入组织裂解液(组织裂解液的成分：50 mmol/L Tris-Hcl、150mmol/LNaCl、0.25%去氧胆酸钠、1%Np-40)，组织经匀浆、超声破碎后，用BCA法进行蛋白定量。10% 的SDS-PAGE凝胶电泳9道，每道上样量为30 g，室温下86V SDS-PAGE胶电泳至分离胶后变电压为104V电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电

21、泳。根据蛋白质分子量的大小半干转适当的时间。半干转后的PVDF膜用TBST漂洗3次，每次10 min。5%脱脂奶粉室温封闭1 h后, 一抗ERK、p38、JNK兔单克隆抗体和磷酸化ERK、p38、JNK兔单克隆抗体(Cell Signaling, USA，1:1000)4孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(中杉金桥,北京，1:1000)室温孵育1h，TBST洗膜3次，每次10 min加入免疫印迹化学发光试剂室温下反应3 min，暗室曝光10 min，显影和定影。扫描条带，并用图像分析系统进行分析。统计学处理：所有数据采有SPSS11.5软件进行统计分析

22、，计量资料数据经正态检验均为正态分布(P>0.05)，用 ±s表示表示，经方差齐性检验方差均齐(P>0.05)，各组间数据比较采用单因素方差分析q检验, 进行组间两两比较。结 果1 枫叶黄酮对衰老模型大鼠学习、记忆能力的作用第15 d模型组逃避潜伏期较假手术组明显延长(P<0.05)，治疗组逃避潜伏期较模型组明显缩短(P<0.05，Fig. 1A)。以大鼠60 s 内在平台各象限的逗留时间所进行的空间探索实验证明：MWM实验最后1d，撤除平台后，60 s 内各组大鼠在原平台所在的第象限逗留的时间比较：模型组在第象限逗留的时间较假手术组明显缩短 (P<0.

23、05)，治疗组在第III象限逗留的时间较模型组明显增加(P<0.05)，且假手术组和治疗组在第象限逗留的时间较在其他各象限的逗留时间明显增加(P<0.05)，模型组在第象限逗留的时间较在其它各象限的逗留时间差异无统计学意义(P>0.05，Fig. 1B)。此外，以模型大鼠跨越平台次数所进行的空间探索实验表明：模型组跨越平台次数较假手术组明显减少(P<0.05)， 治疗组跨越平台次数较假手术组明显增加(P<0.05，Fig. 1C)。Fig. 1 The results of place navigation and spatial probe test. The

24、escape latencies in 7 days (A), The time of staying every quadrants of platform in 60 seconds (B) and the number of crossing over a platform in 60 seconds (C). aP < 0.05 s sham group, bP < 0.05 s model group.2 枫叶黄酮对衰老模型大鼠皮质MDA、GSH、GR、GSH-PX、T-SOD的作用模型组MDA的含量较假手术组显著增加(P<0.05)，治疗组MDA的含量较模型组显著

25、减少(P<0.05，表1，Fig. 2A); GSH和T-SOD的含量在三组间差异没有统计学意义(P>0.05)(表1，Fig. 2B, E);模型组GR和GSH-PX的含量较假手术组显著减少(P<0.05)，治疗组GR和GSH-PX的含量较模型组显著增加(P<0.05，表1，Fig. 2C, D)。Fig. 2 The concentration of the MDA, GSH, GR, GSH-PX and T-SOD in cerebral cortex of different groups. aP < 0.05 s sham group, bP <

26、0.05 s model group.3.免疫印迹法检测衰老模型大鼠大脑皮质MAPK磷酸化模型组ERK蛋白的磷酸化水平明显低于假手术组(P<0.05)，而治疗组ERK蛋白的磷酸化明显高于模型组(P<0.05，Fig. 3);模型组p38和JNK蛋白的磷酸化明显高于假手术组(P<0.05);治疗组磷酸化水平与模型组相比较：出现p38和JNK蛋白的磷酸化水平明显下调 (P<0.05，Fig.3);ERK、p38和JNK的表达在三组间差异无统计学意义(P>0.05，Fig.3)。Fig. 3 The western blotting for ERK, p-ERK, p3

27、8, p-p38, JNK and p-JNK in different groups rats.1-3: sham group; 4-6: model group; 7-9: treatment group.讨 论探究衰老的机制、寻找延缓衰老的方法一直是人类科学研究的重要内容之一。近年来随着我国人口的迅速老龄化，中枢神经系统退行性疾病日益增多，给社会和家庭带来沉重的负担。其中AD的发病机制及治疗仍是一个世界性难题。众多研究者已从不同角度提出了AD发病机制学说，如胆碱能功能低下假说、炎症或免疫假说、基因突变假说、淀粉样蛋白假说、氧化应激及兴奋性毒性假说和凋亡假说等。其中，氧化应激学说受到众多学

28、者的关注，活性氧(reactive oxygen species, ROS)是指由氧衍生出来的自由基及其产物，包括过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2-)、羟自由基(OH-)等。在生理状态下，ROS可单独或作为多种细胞因子和刺激因素的介质激活细胞内多条信号通路，引起转录因子的活化与基因表达，导致细胞增殖分化或凋亡等效应。与此同时，生物体内存在一个有效抵抗氧化应激的抗氧化剂(antioxidants)防御系统。其中以内源性巯醇抗氧化剂(酶)最为重要，它主要包括GSH合成与代谢调节的相关酶如：GSH-PX及GR等。细胞内活性氧和抗氧化剂之间保持着动态平衡，当活性氧簇氧化能力超出内源性抗氧化剂的清

29、除能力时，细胞即进入氧化应激(oxidative stress)状态。导致细胞老化、死亡等氧化损伤。越来越多的研究证明，氧化应激直接参与了AD等多种神经退行性疾病的病理过程9。AD患者在未出现特征性病理改变之前即可发生明显的氧化损伤10。并且A生成与活性氧产生之者间具有明显相互促进效应11。ROS被认为是细胞内新的第二信使在信号转导中起重要作用，并能激活MAPK12。MAPK是细胞内一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以被不同的细胞外刺激，如细胞因子、细胞应激、神经递质等激活。在哺乳动物细胞中已发现和克隆了ERK、JNK/应激激活的蛋白激酶(stress activated protein kina

30、se，SAPK)、p38、ERK5/BMK1(big MAP kinase )4个MAPK亚族。神经细胞骨架蛋白的异常磷酸化是AD 的早期事件，但机制不清。ERK分为ERK1 和ERK2，统称为ERK1/2，研究表明ERK1/2主要被各种生长因子、离子射线、过氧化氢等磷酸化而激活，进入细胞核作用于E1k-1, c-myc, c-fos, c-jun，ATF，NF-kB和AP-1等转录因子，促进某些基因的转录、表达和细胞的增殖与分化，ERK是神经细胞重要的保护和存活因子，ERK在AD中活性受到抑制13。p38 参与了炎症、应激和细胞周期调控等病理生理过程;可被多种刺激所激活，包括激素、氧化应激、

31、促炎细胞因子、紫外光及高渗状态等，引起细胞增殖、分化、凋亡及细胞因子的合成，p38通路在神经损伤中发挥了极其重要的作用，有研究证实p38激活可能与老年斑形成和神经纤维缠结有密切关系，抑制p38激活，可作为其神经保护作用机制之一14。JNK家族是1990年被发现的MAPK超家族成员之一，属于进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。以JNK为中心的JNK信号通路可被细胞因子、生长因子、应激( 如电离辐射、渗透压、热休克和氧化损伤) 等多种因素激活，大量实验提示JNK信号通路在细胞分化、细胞凋亡、应激反应以及多种人类疾病的发生与发展中起着至关重要的作用。包括在AD的许多神经退行性病变中，氧化应激优先激活

32、JNK/c-Jun15，JNK/c-Jun激活后可激活-分泌酶，导致A沉淀产生16，抑制JNK/c-Jun激活可以减少神经受损17，这表明JNK/c-Jun在AD发病及进展中发挥重要作用。由此可见，MAPK信号转导通路与AD的发生与发展密切相关，为AD等神经退行性疾病的治疗提供新的思路。近年来随着对黄酮类物质研究的不断深入，发现黄酮有抗氧化应激作用，但枫叶黄酮对内源性抗氧化剂，特别是巯醇抗氧化剂(酶)的调控及对MAPK信号通路的影响未见系统报道。本实验发现：模型组大鼠较假手术组大鼠逃避潜伏期明显延长，在第象限逗留的时间明显减少，跨越平台次数明显减少，而经枫叶黄酮预防性治疗后，大鼠逃避潜伏期明显

33、缩短，在第象限逗留的时间明显增加，跨越平台次数明显增加;表明枫叶黄酮能改善大鼠的学习记忆能力，具有抗衰老作用。模型组大鼠大脑皮质GR和GSH-PX含量较假手术组显著降低，MDA含量显著增加;模型组大鼠大脑皮质中p-JNK和p-p38磷酸化程度明显高于假手术组，p-ERK磷酸化程度明显低于假手术组，ERK、JNK和p38的表达在三组间没有差异。而经枫叶黄酮预防性治疗后逆转上述变化。这可能是因为侧脑室注射A1-42联合腹腔注射D-gal诱导大鼠大脑皮质活性氧生成增加，内源性巯醇抗氧化物(酶)大量被消耗，同时激活JNK和p38，抑制ERK磷酸化。而枫叶黄酮对抗A1-42联合D-gal诱导大鼠大脑的氧

34、化应激效应。综上所述枫叶黄酮能改善学习记忆能力，对抗大鼠神经系统衰老，其作用机制可能是通过上调衰老模型大鼠大脑皮质内源性巯醇抗氧化物(酶)GR和GSH-PX的含量，抑制p38、JNK磷酸化并增强ERK磷酸化。参 考 文 献1 Alzheimer's Association. 2011 Alzheimer's disease facts and figures J. Alzheimers Dement, 2011, 7: 208-244.2 Kumar A, Dogra S, Prakash A. Protective effect ofnaringin. a citrus fl

35、avonoid, against colchicine-induced cognitive dysfunction and oxidative damage in rats J. Med Food, 2010, 13: 976-984.3 李云志, 曾凡俊. 元宝枫叶黄酮类化合物分离与鉴定 J. 天然产物研究与开发, 2006, 3 (18) : 426-427.4 Mak YT, Chan WY, Lam WP, et al. Immunohistological evidences of Ginkgo biloba extract altering Bax to Bcl-2 express

36、ion ratio in the hippocampus and motor cortex of senescence accelerated mice J. Microsc Res Tech, 2006, 69: 601-605.5 Shi C, Xiao S, Liu J, et al. Ginkgo biloba extract EGb761 protects against aging-associated mitochondrial dysfunction in platelets and hippocampi of SAMP8 mice J. Platelets, 2010, 21

37、: 373-379.6 Lu G, Wu Y, Mak YT, et al. Molecular evidence of the neuroprotective effect of Ginkgo biloba (EGb761) using bax/bcl-2 ratio after brain ischemia in senescence-accelerated mice, strain prone-8 J. Brain Res, 2006, 1090: 23-28.7 包新民, 舒斯云. 大鼠脑立体定位图谱M.北京:人民卫生出版社, 1991: 12.8 Kerr AL, Steuer EL

38、, Pochtarev V, et al. Angiogenesis but not neurogenesis is critical for normal learning and memory acquisition J. Neuroscience. 2010, 171: 214-226.9 Aliev G, Obrenovich ME, Reddy VP, et al. Antioxidant therapy in Alzheimer's disease: theory and practice J. Mini Rev Med Chem, 2008, 8: 1395-1406.10 Shi Q, Gibson GE. Oxidative stress and transcriptional regulation in Alzheimer disease J. Alzheimer Dis Assoc Disord, 2007, 21 (4) : 276-291.11 Kim MJ, Lee J, Seong AR, et al.Neuroprotective effects of Eriobotrya japonica against -amyl