ADVIA 2120 分析原理

1、- 20 - ADVIA 2120 分析原理基本原理1 Flowcytometry 流式细胞学原理待检样本在反应池中与试剂进行前处理，再经由仪器液路控制进入Flowcell(流动比色池)进行测定。Flowcell测定的原理主要是应用特定的光源打在血球上产生散射，并利用设置在不同角度的信号探测器，探测光线散射和吸收的情况，经过信号分析运算就可以得到相关的血球特性资讯（如：体积，内容物浓度，密度），配合多个不同的Flowcytometry装置所收集足够的血球信息，就能够得到完整的血球计数以及分类的结果。2.MIE光散射理论MIE光散射理论：光线照射在颗粒上所造成之光散射强度测定公式如下S = F（

2、l，a，t，j，b）S 散射光强度 l使用波长 a 折射率 t 容积 j 测量角度 b 形状因子应用以上公式，固定其中几个因子，就可以测定出血球或者特定颗粒的折射率与体积若将血球球形化，应用固定波长的光源，设置两个固定角度的光线探测器（高角度H，低角度L），带入这个公式：SL = F1（l，a，t，jL，b）SH = F2（l，a，t，jH，b）分解这个方程式可以得到容积与折射率的计算方式：容积a = f1（l，SL，SH ，jL，jH，b）折射率t = f2（l，SL，SH ，jL，jH，b）应用MIE光散射理论，将可测定出血球的体积（容积）与血球的内容物浓度（折射率）。3.Cluster

3、Analysis群组分析当血球细胞经过Flowcell测定后，可得到血球细胞分布图（如下），如何通过统计学与电脑运算方式来界定各种类细胞，是血球分析仪是否准确的重要因素，其中：Cluster Analysis（群组分析）普遍应用在血球分析，此技术能精确的计算出如下数个群组的分界，不但定义出正常的细胞族群，对于异常细胞的出现也能提供敏感的讯息。4.UFC(Uni-Fluidics Circuit) 集成流路系统集成流路系统就是将传统血球记数仪中所应用的管路，反应池，控制阀，试剂运送，管路清洗等功能加以整合，利用UFC特殊材质的去极性及无变形的特性，增加仪器的稳定度与降低定期保养工作频率。5光源应

4、用最新科技的二极管激光发生器，具有光源稳定，体积小，寿命长的特性。LASER SCATTER 激光散射测定测定项目：RBC/PLT，BASO，RETICDARK FIELD OPTIC 卤素灯测定测定项目：白血球分类6Flowcell 结构1Flowcell 2.shuttle Nipple 3.Sample Nipple 4.Sheath Nipple5.Optics Lens 6.Mirror 7.Low angle detector 8.Hi angle detector9.light sourceFlowcell运作原理：鞘液经由Sheath Nipple进入Flowcell形成一稳定

5、介质，再将处理过的细胞（稀释，染色或球形化）经由Sample Nipple以稳定的流速注入Flowcell，当细胞通过光源时会因不同的细胞特征（体积，染色程度，血红素浓度或核密度）产生不同程度的散射，再由Flowcell后方两个探测器（高角/低角）测定光线变化，两个探测器所收集到的信号加以分析计算，就可以得到所需要的细胞特征。7.RBC/PLT反应测定原理测定项目：红细胞计数与形态分析反应：稀释，球形化，固定全血样本2ul与RBC/PLT稀释液1250ul混合，形成625倍稀释，此步反应主要是将红细胞形态改变，由原来的“双凹圆盘型”改变为球形即球形化，试剂中含有固定剂可以使改变形态的红细胞保持

6、稳定，以利于光学法测定细胞体积与血红素浓度。MIE光散射理论的应用血液经前处理后，样本中所含的红细胞，血小板等均呈圆球状，经由流体力学的控制，血球可以依序进入Flowcell，并通过激光照射后出现不同的光散射，利用高/低角度探测器分别测量在此两角度的吸光度变化，就可以测定出细胞的物理特性：如细胞体积，内容物浓度，血红素浓度等参数。MIE MAPMAP直交展开红细胞分布图（九分图） 1. 60fl 2. 120fl 3. 28g/dl 4. 41g/dl红细胞分布图相对位置 红细胞碎片 2.高色素红细胞3.红细胞4.血小板 1.小红血球阈值 2.大红血球阈值 3.低血色素阈值 4高血色素阈值血小

7、板分布图相对位置1.血小板 2.大血小板 3.红细胞4.红细胞碎片 5.噪音 6.红细胞阴影8BASO通道测量原理主要反应：破坏红血球，血小板，白细胞裸核化全血样本12ul与BASO稀释液500ul混合，形成41.6倍稀释, BASO稀释液为强酸性溶液可将样本中红细胞，血小板，以及嗜碱细胞(保持原态)以外的所有白细胞（裸核化）加以破坏，在经由流体控制将嗜碱细胞及裸核化的白细胞送入Flowcell,当血球经过激光照射后，应用MIE理论，测定高/低角度信号变化，就可以得出细胞体积与核密度。MIE光散射理论之应用如上图，为BASO通道细胞处理后示意图，低角度散射光变化可以测出细胞体积，高角度光为核密

8、度，形成右下角的细胞分布图，其中，嗜碱细胞因为保留完整的细胞膜。体积相较之下比其他白细胞的裸核大，因此分布在细胞分布图的上方，其余的裸核则聚集在细胞分布图的下半部分，且依照其细胞核的核密度分布，越靠近X轴左边表示核密度低或者单核，越靠近X轴右边表示核密度高或者多核。 单个核白细胞分布在左半区，包含：Monocyte,Lymphocyte,多个核白细胞分布在右半区，包含：Eosinophil,Neutrophil,NRBC利用单核细胞与多核细胞的分布就可以算出Lobularity Index,如图所示，此Index为以前判断是否左移的主要依据BASO通道细胞分布图（正常状态） 1.噪音 2.原始

9、细胞 3.MN（单核） 4.Basophile嗜碱5.Baso-Suspect可疑嗜碱 6.饱和区 7.PMN（多核）8.NRBC（有核红细胞）BASO（PMN/MN）不能清楚分辨时，将出现以下分布图 1噪音2. 原始细胞 3.MN（单核）4.Basophile嗜碱5.Baso-Suspect可疑嗜碱 6.饱和区7.PMN（多核） A. Noise/Baso阈值 B. 原始细胞阈值 C. MN/PMN阈值 D.BASO/裸核阈值 E. BASO/ 饱和阈值9.Retic反应：红细胞球形化及RNA染色全血样本2ul加入auto retic试剂1250ul混合试剂中含有RNA染剂Oxazine75

10、0,可渗透至网织红细胞细胞膜内，将细胞质内的RNA加以染色，细胞质内含有RNA的网织红细胞将被染成蓝色，且依照RNA含量的多少反应染色的程度，细胞膜内不含RNA的红细胞与血小板则不被染色。网织红细胞的成熟过程：Heilmeyer成熟度分期网织红细胞成熟过程的分期主要以活体染色后，RNA染色的形态及RNA含量作为分类依据，以下为网织红细胞的分期与存在位置。O Type:具有染色颗粒与细胞核的有核红细胞I-IV Type:具有RNA染色颗粒的无核红细胞。MIE光散色理论应用：计算细胞数量及特性分析利用RBC/PLT Channel的光学系统，当细胞通过激光产生散射，再利用信号探测器测量各角度散射光

11、强度，应用MIE原理计算：低角度散射光可测定出细胞体积，高角度散射光可测定细胞血红素浓度，吸光度变化的测量可以计算出RNA染色浓度，利用以上三个测定植就可以得到完整的网织红细胞分析。网织红细胞分布图 Retic/PLT阈值2.同时通过细胞阈值 3.Retic/Mature RBC阈值 4. Low/Med阈值5.Med/High阈值A.成熟红细胞B.低吸光ReticC. 中吸光ReticD. 高吸光ReticE. PLT/Retic阈值F. 同时通过细胞每颗网织红细胞所含的Hgb含量计算公式：MCH(pg)=MCV(fl)*MCHC(g/dl)/10010.PEROX白细胞分类（过氧化酶染色）

12、反应：破坏红细胞，加热固定白细胞，过氧化酶染色第一步骤：全血样本12ul加入250ul Perox 1,反应池加热到70度进行红细胞破坏之反应及第二步骤 用Perox 1中甲醛固化WBC及包膜皱缩。（17 秒）第三步骤：同时加入125ul Perox 2，主要成分为4Chrolo-1Naphol之呈色剂，及250ul Perox 3，主要成分为H2O2，为过氧化酶反应中的底物，释放出O与呈色剂反应，在胞浆中产生黑色沉淀.（13秒） H2O +4Chrolo-1Naphol - 过氧化酶细胞-à细胞内黑色沉淀测定：染色后的白细胞利用光学法测定染色程度，细胞体积，细胞数量白细胞过氧化酶活

13、性：Eosinophil:4+ ，Neutrophil:2+to3+， Monocyte: weak+Lymphocyte: negative Basophil: negative染色后的白细胞通过Flowcell时，透过卤素灯为光源的白色光照射将造成不同程度的光线散射，利用Flowcell后方的两个探测器探测散射光的强弱，即可测定出白细胞的体积。染色程度，组成过氧化酶染色的细胞分布图Peroxidase Cytograme 细胞分布图 1噪音（红细胞，血小板碎片）2.有核红细胞3.血小板凝集4.淋巴+嗜碱5.LUC6.单核7.中性8.嗜酸11.Hgb血红素反应：氰化血红素比色法全血样本2ul

14、加入500ul Hgb稀释液，主要成分为KCN及表面活性剂，可以将样本中的红细胞破坏，红细胞中的血红素与KCN反映呈色后，测定透光度的变化，再以鞘液的透光度作为背景值，利用透光度和背景值的差值就可以计算出样本中血红素的浓度。测定光源波长：546nm 前一样本2.样本与试剂打入反应池3.血红素透光度测定4.反应池清洗5. 鞘液透光度测定12，Mophology Flag 判定标准1ANISOCYTOSIS (ANISO)+RDW = 16.0 % to 17.9 %+RDW = 18.0 % to 22.0 %+RDW > 22.0 % 2MICROCYTOSIS (MICRO)+%MIC

15、RO = 2.5 % to 6.4 %+%MICRO = 6.5 % to 10.5 %+%MICRO > 10.5 % 3MACROCYTOSIS (MACRO) +%MACRO = 2.5 % to 6.4 %+%MACRO = 6.5 % to 10.5 %+%MACRO > 10.5 % HGB CONCENTRATION VARIANCE (HCVAR)+HDW = 3.4 g/dL to 3.9 g/dL+HDW = 4.0 g/dL to 4.5 g/dL+HDW > 4.5 g/dL HYPOCHROMIA (HYPO)+%HYPO = 4.0 % to 7.9 %+%HYPO = 8.0 % to 12.0 %+%HYPO > 12.0 % HYPERCHROMIA (HYPER) +%HYPER = 4.0 % to 7.9 %+%HYPER = 8.0 % to 12.0 %+%HYPER > 12.0 %ATYPICA