鹿茸顶端组织GHR基因的cDNA克隆及组织定位_图文

1、第36卷第9期西北农林科技大学学报(自然科学版Vol.36No.9 2008年9月Journal of Northwest A&F University(Nat.Sci.Ed.Sep.2008鹿茸顶端组织GHR基因的cD NA克隆及组织定位李艳梅1a,贾康胜2,杨鸣琦1a,徐秀容1b(1西北农林科技大学a动物医学院,b动物科技学院,陕西杨凌712100;2陕西省珍稀野生动物抢救饲养中心,陕西西安710402摘要【目的】检测鹿茸顶端组织GHR基因的表达,为鹿茸再生的分子机理研究提供理论依据。【方法】根据GenBank已发表的牛、山羊和绵羊生长激素受体(GHR基因序列,用CL USTAL

2、W软件进行同源性分析,在保守序列设计克隆鹿GHR基因编码序列的引物。以34岁健康鹿生长30d的鹿茸顶端组织提取的总RNA为模板,利用R T2PCR技术克隆GHR基因的cDNA序列;并用原位杂交技术对GHR基因在鹿茸顶端进行组织定位。【结果】成功克隆到了1967bp的序列(G enBank登陆号为EU381142,该序列包含GHR基因的全部编码序列。鹿GHR基因与牛、羊、人GHR核苷酸同源性分别为97%,97%和80%,GHR蛋白氨基酸序列同源性分别为97.9%,97.6%和77.3%。杂交结果显示,在皮肤层、间叶细胞层、软骨膜层和软骨层的阳性组均有蓝色杂交信号。【结论】利用R T2PCR技术和

3、原位杂交技术在鹿茸顶端皮肤层、间叶细胞层、软骨膜层和软骨层均检测到GHR的表达。关键词鹿茸;GHR;基因克隆;原位杂交中图分类号Q786文献标识码A文章编号167129387(20080920005206cDNA cloning and tissue localization of GHR gene in antler tipL I Yan2mei1a,J IA Kang2sheng2,YAN G Ming2qi1a,XU Xiu2rong1b (1a College of V eteri nary Medicine,b College of A ni mal S cience,N ort h

4、west A&F Universit y,Yangling,S haanx i712100,China;2Rare W il d A ni mal Rescuing and Feeding Center of S haanxi,X ian,S haanx i710402,ChinaAbstract:【Objective】The st udy was to detect exp ressio n of GHR in antler tip to p rouide t heoretical basis for regeneratio n of anter molecular machanis

5、m.【Met hod】A pair of primers were designed according to t he homology region of GHR among ot her species.Total RNA was isolated f rom antler tip,t he growing antlers from3-4years spotted deer were removed on t he30t h day after t he mineralized ones shed,and t he cDNA sequence of GHR gene was cloned

6、 by R T2PCR technology.Then,in sit u hybridization was per2 formed to detect exp ression of GHR in t he antler tip.【Result】Co mplete coding sequence of GHR gene was cloned(GenBank accepted number is EU381142,including1967bp.Compared wit h ot hers,t he homology of GHR to bovine,ovine and human was97%

7、,97%and80%respectively,but t he homology of protein was 97.9%,97.6%and77.3%respectively.Hybridization signals were obtained using in sit u hybridization.【Conclusion】The result s of R T2PCR and in sit u hybridization showed t hat four regions had expression of GHR in deer antler tip.K ey w ords:deer

8、antler;GHR;gene cloning;in sit u hybridization3收稿日期2008203226基金项目西北农林科技大学博士科研启动费(01140501作者简介李艳梅(1981-,女,河北唐山人,在读硕士,主要从事动物生理学研究。E2mail:7311647通讯作者徐秀容(1969-,女,湖北英山人,副教授,博士,主要从事生物技术与动物遗传育种研究。E2mail:xiurong_xu鹿为现存惟一可再生茸的动物,是目前继家畜后驯化程度最高的经济动物之一122。鹿茸是一种特殊的骨组织,其上没有肌肉附着,而是由一层竖毛的表皮所覆盖,内含胶质等前成骨组织,富含血管和神经3。鹿

9、茸是哺乳动物惟一在失去后还能完全再生的器官,是研究哺乳动物器官再生及创伤修复的理想动物模型4。在鹿茸的生长期(约90120d骨轴的延伸很快,可达12cm/d,相应表皮层也生长很快,以便覆盖新增长的骨质,且每年鹿茸都进行周期性替换即鹿茸的再生,因此人们推测鹿茸中可能存在某种活性物质,控制并刺激鹿茸的生长。胰岛素样生长因子21(IGF21最有可能是该种活性物质,其是骨吸收和骨形成的重要偶联因子。生长激素(GH做为一种重要的内分泌因子,对骨骼的作用复杂,在骨细胞中GH与其特异性受体生长激素受体(GHR结合,通过J A K22MA P K2STA T途径促进I型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素的表达和分泌。动

10、物模型研究表明,注射GH可以加速骨重建,增加骨量和骨强度,促进骨折愈合5。Suttie等6研究发现,赤鹿血液中的GH水平与鹿茸生长有一定相关性,但至今还未见证明GH直接参与鹿茸软骨细胞增殖和分化的相关研究报道。为此,本研究通过原位杂交技术检测了鹿茸顶端组织GHR的表达情况,以期为鹿茸再生的分子机理研究提供理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1试验动物取生长30d34岁鹿的鹿茸(陕西银户生态产业园:一部分放入液氮中带回实验室,保存于-80,用于RNA提取;另一部分立即切成约1.5cm×1.2cm×0.2cm大小,放入40g/L多聚甲醛中固定34h,转到150g/L蔗糖溶液

11、中过夜,然后倒掉蔗糖溶液保存于-80,用于原位杂交。1.1.2主要试剂Trizol试剂盒、反转录试剂盒RevertAid TM First St rand cDNA Synt hesis K it和dN TP Mixt ure为Invit rogen公司产品,L A T aq DNA Polymerase和p MD218T vector为Ta KaRa 公司产品,DNA Marker和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司,E.coli D H5、H.Q.&.Q质粒微量提取试剂盒购自安徽优晶生物工程有限公司,T7RNA聚合酶和地高辛标记及原位杂交试剂盒为Roche公司产品。

12、1.2引物设计与合成根据GenBank发表的牛、羊GHR基因cDNA 序列,在高度同源区设计引物。其中GSP2GHR为反转录引物,GHR2CDS为以cDNA第一链为模版扩增鹿GHR基因编码序列的引物,引物序列见表1。引物均由上海英俊生物工程服务有限公司(in2 vit rogen合成。表1GHR的引物序列Table1Primers sequences of GHR基因Gene 引物序列Primer产物长度/bpLengt h of amplified fragmentGSP2GHR52A T TCA T GCCCCA GCCAAC23GHR2CDS F:52GGTCCTACA GGTA T G

13、GA TCTCT GG23R:52A GCCAACCCT GT GCCA T TC231967GHR1 GHR2F:52CCT GTCCCA GA T TA TACCTCCA23R:52CCAACCCT GT GCCA T TCAA23196GHR12T F:52TAA TACGACTCACTA TA GGG CCT GTCCCA GA T TA TACCTCCA23GHR22T R:52TAA TACGACTCACTA TA GGG CCAACCCT GT GCCA T TCAA231.3鹿茸顶端组织GHR基因的克隆1.3.1总RNA的提取用Trizol试剂盒提取鹿茸顶端组织的总RNA,提取

14、的总RNA用15g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测。1.3.2R T反应以基因特异性引物GSP2GHR 为反转录引物,鹿茸顶端组织总RNA为模板反转录合成cDNA第一链。在反应体系中分别加入总RNA2.0L,4mol/L GSP2GHR0.5L,10mmol/L dN TP Mixture1.0L和D EPC水9.5L,于65孵育5min,立即置冰上冷却后加入下列试剂:5×First2St rand Buffer4.0L,0.1mol/L D T T 1.0L,40U/L RNase inhibitor 1.0L,200 U/L SuperScript TMR T1.0L,反应总体积20L

15、。在PCR仪中,50反应60min,70孵育15min后终止反应,冰上冷却。1.3.3PCR反应PCR反应体系为20L:46西北农林科技大学学报(自然科学版第36卷mol/L上、下游引物各2.0L,2.0L10×PCR Buffer,1.6L25mmol/L MgCl2,2.0L2mmol/L dN TP Mixture,8.8L灭菌的二蒸水,0.2L5 U/L L A T aq DNA Polymerase,1.4L cDNA模板。反应条件:954min;9430s,6030s, 722min,38个循环;727min,4保存。利用MyCycler TM Thermal Cycle

16、r(BIO2RADPCR仪进行扩增。PCR产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测。1.3.4扩增片段的分离和克隆利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,从普通15g/L琼脂糖凝胶上回收特异性条带,回收产物连接于p MD218T载体,转化感受态 E.coli D H5,涂布平板,进行蓝白斑筛选,然后分别接种于10mL LB培养基中,37振荡过夜培养。1.3.5重组质粒的酶切鉴定将抽提的质粒经Eco R和H i n d双酶切鉴定。经PCR和限制性内切酶酶切鉴定均为阳性的克隆,交由上海生工生物工程有限公司测序。1.4原位杂交试验将1.1.1中已固定好的组织修块,用A PES处理的载玻片贴片,制备冰冻切片,冰

17、冻切片的厚度为10m。1.4.1探针制备根据GHR基因编码序列测序结果,设计引物GHR1和GHR2(详见表1。GHR1和GHR2加上T7启动子接头后的引物为GHR12T和GHR22T,然后分别以GHR12T和GHR2,GHR1和GHR22T为引物克隆到长度为196bp的序列。PCR产物回收纯化后作为转录模板,用T7RNA聚合酶转录,地高辛标记,分别转录出与mRNA互补的cRNA(阳性探针及与mRNA 链序列相同的探针RNA(作为阴性对照。1.4.2预杂交在DEPC处理的PBS(p H7.4中孵育切片2次,每次5min,用不含RNA酶的1g/mL蛋白酶K在37下通透切片30min,4下用DEPC

18、处理的PBS溶液配制的40g/L多聚甲醛后固定切片5min,DEPC处理的PBS冲洗切片2次,每次5min,0.1mol/L三乙醇胺(TEAp H8.0振荡漂洗2次,每次5min,再用DEPC处理的PBS 冲洗切片1min,37预杂交液中孵育切片60min。1.4.3原位杂交弃去预杂交液,每张切片滴加3040L的杂交液(4×SSC,100g/L dext ran sul2 fate,1×Denhardts solution,2mmol/L ED TA, 500mL/L deionized formamide,500g/mL鲑鱼精DNA,RNA探针,用原位杂交专用的杂交膜(h

19、y2 drop hobic plastic coverslip覆盖切片,置42湿盒内孵育切片16h。1.4.4杂交后处理37将切片浸泡于2×SSC 中510min,去掉杂交膜,37用含600mL/L甲酰胺的0.2×SSC冲浸泡冲洗切片2次,每次15 min,2×SSC洗切片2次,每次510min。1.4.5杂交后显色Buffer(p H7.5振荡漂洗切片2次,每次10min,每张切片滴加40L bloc2 king reagent孵育30min,用blocking Buffer(含1200稀释的羊抗地高辛抗体A KP结合物孵育切片2h,在Buffer中洗切片2次,

20、每次10min,Buffer (p H9.5中孵育切片10min,每张切片滴加100L显色液,在暗室下显色16h(224h,显色后用Buffer(p H8.1终止显色反应,双蒸水冲洗切片,甘油封片,晾干后拍照观察。2结果与分析2.1鹿茸顶端组织提取总RNA的检测检测结果显示,提取的鹿茸顶端组织总RNA 5S,18S和28S3条带清楚可见,条带整齐(图1,表明提取的总RNA没有降解,完整性较好,可用于后续试验 。图1鹿茸顶端组织提取总RNA的电泳结果Fig.1Electrophoresis profiles of totalRNA f rom antler tip2.2鹿GHR基因编码序列的克隆

21、利用R T2PCR技术扩增鹿茸顶端组织GHR基因编码序列,PCR产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测,得到一条约2000bp的特异性条带(图2,与目的片断大小相符。2.3重组质粒的酶切鉴定PCR产物连接至克隆载体pMD218T后转化感受态 E.coli D H5细胞,抽提质粒DNA,用PCR方法对阳性克隆进行初步筛选,然后经Eco R和H i n d双酶切,可见2个DNA片段(图3,大小分别与线性p MD218T载体和鹿GHR基因相一致。7第9期李艳梅等:鹿茸顶端组织GHR基因的cDNA克隆及组织定位 图2鹿茸顶端组织GHR 基因PCR 产物的电泳结果M.Marker ;1,2.GHR 基因

22、Fig.2Electrophoresis result of GHR PCR productsM.Marker ;1,2.GHR gene图3重组质粒的Eco R 和Hin d 酶切鉴定Fig.3Eco R and Hin d restrication identificationof recombinant plasmid2.4鹿GHR 基因的同源性分析测序结果表明,克隆的序列长度为1967bp 。比对分析表明,该序列为鹿GHR 基因cDNA 序列,从第13位到1917位为CDS 区。序列已经向Gen 2Bank 提交,登陆号为EU381142。将编码区与Gen 2Bank 中已发表牛、羊和

23、人的GHR 基因序列进行比对,核苷酸同源性分别为97%,97%和80%,GHR 蛋白氨基酸序列同源性分别为97.9%,97.6%和77.3%。表明在鹿与牛、羊间GHR 基因和GHR 蛋白的同源性均较高。在鹿、羊和牛GHR 基因的氨基酸序列中,118氨基酸片段为信号肽序列,145246氨基酸片断为FN3结构域序列。在GHR 肽链末端的细胞外配体结合区域的氨基酸序列中,鹿与羊、牛的同源性更高,鹿和羊该区域的氨基酸序列完全相同,而鹿与牛的仅有1个氨基酸残基不同,鹿的GHR 位点为亮氨酸残基,牛的为甲硫氨酸残基。2.5原位杂交用地高辛标记的RNA 探针,BCIP/NB T 显色系统在鹿茸顶端组织的冰冻

24、切片上进行原位杂交,图4中箭头所示蓝色颗粒为杂交阳性信号。杂交结果显示,在皮肤层、间叶细胞层、软骨膜层和软骨层的阳性组均有蓝色杂交信号,而阴性对照组均无杂交信号,说明以上各层均有GHR 基因的表达。3讨论研究发现,GH 和IGF 21在骨代谢中起重要作用728,GH 的大部分生理功能是通过IGF 21实现的,GH 与其受体GHR 结合后,直接或通过上调IGF 21的表达间接发挥对骨细胞的调节作用;GH 也可以通过IGF 21的介导作用于软骨细胞,促进其增殖和基质形成9。研究证实,在鹿茸顶端可检测到IGF 21及其受体的表达10212。体外培养试验表明,IGF 21促进鹿茸软骨细胞的增殖和分化4

25、。而Elliott 13通过放射自显影和RRA 技术在鹿茸各部位中只检测到IGF 21受体,没有检测到GHR 的分布。原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的试验技术之一,同时也是生物体发育研究过程中的一种极为重要的分子遗传学研究方法14215。由于地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色(标记碱性磷酸酶2抗碱性磷酸酶显色系统,有较好的反差背景;RNA 探针是单链分子,所以它与靶序列的杂交反应极高,有报告认为其杂交率高于DNA 探针的8倍,因此本试验采用地高辛标记的RNA 探针进行原位杂交,以获得更好的杂交信号。本试验结果显示,在鹿茸顶端组织存在GHR 基因的表达,并且从鹿茸顶端组织成功克隆出GHR c

26、DNA 编码区全长序列,其与牛和羊的GHR 基因在核苷酸和氨基酸水平都具有较高的同源性。本试验分析了牛、羊和鹿GHR 基因的氨基酸序列同源性,结果显示,鹿的GHR 与牛、羊GHR 的氨基酸序列同源性分别达到97.9%和97.6%,与GHR 肽链末端的细胞外配体结合区域的氨基酸序列同源性更高,鹿和羊该结构域氨基酸序列完全相同,鹿和牛该结构域仅有1个氨基酸残基不同,鹿GHR 该位点为亮氨酸残基,牛GHR 为甲硫氨酸残基,这两个氨基酸都具有疏水基团。因此,Elliott 13利用牛和羊的GH 为配体检测鹿茸顶部GHR 的分布,检测结果为阴性的原因可能是种属特异性或方法敏感性的差异所致。4结论本试验利

27、用原位杂交试验首次证实GHR 在鹿茸顶端各部位都有表达,还成功克隆了GHR cDNA 编码区全长序列,这为进一步研究GH 2IGF 21轴对鹿茸生长的调控机理奠定了理论基础。8西北农林科技大学学报(自然科学版第36卷 图4GHR mRNA 在鹿茸顶端的定位(×200A.皮肤层GHR mRNA 原位杂交染色;B.间叶细胞层GHR mRNA 原位杂交染色;C.软骨膜层GHR mRNA 原位杂交染色;D.软骨层GHR mRNA 原位杂交染色;a ,b ,c ,d.分别为A ,B ,C ,D 的阴性对照Fig.4Tissue localization of GHR mRNA in antle

28、r tip (×200A.In situ hybridization staining of GHR mRNA in t he velvet skin ;B.In situ hybridization staining of GHR mRNA in mesenchymal cell ;C.In situ hybridization staining of GHR mRNA in perichondrium ;D.In situ hybridization staining of GHR mRNA in cartilaginous zone ;a ,b ,c ,d.Negative c

29、ontrol9第9期李艳梅等:鹿茸顶端组织GHR 基因的cDNA 克隆及组织定位10 西北农林科技大学学报 ( 自然科学版 第 36 卷 参考文献 1 Chap man D I. Antler2bones of contention J . Mammal Rew , 3 王秋玉 ,王本祥 . 论鹿茸生长因子 J . 中医药学报 ,2000 ,6 :10. ation of deer antlers J . Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci , 2004 ,359 (1445 :8092822. 39242. 3512360. (43 :31666231674

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