血吸虫试剂盒主要原材料研究资料

1、血吸虫抗体快速检测试剂盒主要原材料的研究资料1 .血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)(试剂盒检测点原料)(1)制备方法：取人工感染1500条日本血吸虫尾蜗 45d的家兔肝脏，用生理盐水洗净后经高速捣碎机 捣碎，分样筛分离除去肝脏组织，沉淀离心，收集分离虫卵，依次经 200目和300目尼龙 绢过滤，收集滤渣，即为较纯净的血吸虫虫卵。然后加入10倍量的生理盐水，置玻璃匀浆器内制成匀浆，用超声粉碎机超声处理 (1minX10次)，液氮冻融3次，最后以10 000 r/ min 离心30 min ,上清液即为血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA),经0.22um超滤膜过滤除菌后分装，一20C冻存备用。(2)抗原性

2、测定a.测定方法1) 取抗原2001加入比色杯内，用分光光度计测定A280和A260OD值；2) 将抗原用pH9.6碳酸盐缓冲液作1:4、1:8、1:16、1:32、1:64稀释,分别包被于酶标板内 (100ul/孔),37C 3小时；然后倾去抗原液，用洗涤液洗涤3次，每次5分钟；BSA(0.5mg/ml) 为对照，同法操作；3) 加样：分别加已作 1:100稀释的血吸虫抗体检测质控品、阳性和阴性对照血清各100d,空白孔仅加100 /稀释液。置于湿盒内，37 C培育30分钟；4)洗板：取出酶标板，甩去孔内液体，每孔注满洗涤液洗涤 5次，每次均需停留30秒后 再甩净拍干；5)加酶标结合物：除空

3、白对照孔外，每孔加入酶标结合物2滴，37c培育30分钟；6) 洗板：同3;7) 显色：每孔加底物和显色剂各1滴，混匀，37c避光反应10分钟，加终止液1滴，混匀，判断结果。b.判断依据：1) 根据公式计算：样品浓度( mg/ml) = (1.45X A280-0.74 X A260 ) X稀释倍数； 2)肉眼观察：不加终止液观察，基本无色或微蓝色为阴性，呈明显蓝色为阳性；3) 仪器判断：酶标仪上450nm读取OD值，待检样本孔的OD值大于阴性对照 2.1倍者为阳性。c.结果抗原OD值A280nm2.1510抗原OD值A260nm2.5121SJK-DIGFA-008第7页共7页计算公式抗原浓度

4、抗原浓度(mg/ml) = ( 1.45XA280-0.74 X A260 ) X稀释倍数;1.26mg/mlSEA阴参阳参血吸虫抗体检测质控品阳参比值血吸虫抗体检测质控品1:40.050.450.159.033.081:80.040.510.1710.263.481:160.050.520.1910.313.781:320.050.490.189.413.521:640.060.610.2410.924.35BSA0.010.040.010.820.11结论：浓度为1.26mg/ml,经倍比稀释，用于 ELISA检测血吸虫抗体阳性临界血清, 1:64（0.02mg/ml）仍呈阳性结果，具有高

5、度的免疫原性，可用于血吸虫抗体检测（3）工作浓度：SEA的作用是作为检测点，包被于硝酸纤维素膜上，用于检测人血清中特异性抗血吸 虫抗体。因此，其工作浓度的选择对于检测效果的评价是试剂盒研制的关键技术。如果浓度过高，阳性反应色度过强，易产生假阳性结果；反之，浓度过低，则不易辨别，影响检测的 灵敏度。所以，研究目的是选择能较清晰产生反应色度的最低抗原浓度。方法：a. SEA抗原原液浓度测定：以紫外分光光度法测定 SEA抗原原液A280和A260OD值, 根据公式计算浓度（mg/ml） =1.45X A280-0.74 X A260 ;b. SEA稀释：以0.02 mol/L pH8.0 PBS将S

6、EA从1:2至1:10稀释成9个稀释度，与原 液一起分成10个浓度组。c.包被：将上述10个浓度的SEA分别点膜，在每块空白反应板中的硝酸纤维素膜 （德 国Schleicher & Schuell Bioscience,孔径0.45um）上点滴1ul,每个浓度组包被 3块，室温 干燥2小时后加入2滴封闭液（主要成分为牛血清白蛋白） ，待干。c. 效果测试：分别在上述 10个浓度组的金标反应板中央小孔内滴加2滴洗涤液，渗入后于反应板中央加 25止血吸虫抗体检测质控品（参照血吸虫病抗体诊断试剂国家参考品低 感染度血清（P13）制备，方法见附页），待液体充分吸入，加 2滴洗涤液，渗入后分别加

7、 3种 浓度的显色液（即金标二抗，浓度依据A520OD值确定，制备方法见后），每块反应板加1种浓度的显色液，每种显色液均加 4滴，最后加2滴洗涤液，渗入后根据检测点颜色深浅判 断效果。结果：d. SEA 抗原原液 OD 值：A280 为 2.1510, A260 为 2.5121 ,根据公式（mg/ml） =1.45 X A280-0.74 X A260 计算，浓度为 1.26 mg/ml。b.检测效果金标 二抗 浓度SEA抗原稀释度原液1:21:31:41:51:61:71:81:91:101.2+土1.0+土土0.8+土土土土土-注：色度判断：+深，+易见，诫，-无c.最适工作浓度选择：

8、金标二抗浓度在1.2 （A520值）时所有金标反应板的背景较深， 且制备成本高；0.8时，检测效果较差；1.0时的检测效果最好，在抗原稀释度1:8（0.157mg/ml） 仍可清晰显示检测点。因此，抗原最适工作浓度为1:51:8范围内（约0.2 205mg/ml）,而金标二抗的最适工作浓度为1.0 （A520值）。进一步验证试验：以0.2mg/ml工作浓度的SEA抗原为检测点，1.0 （A520值）金标二抗为显色液研制的 血吸虫抗体快速检测试剂盒（斑点免疫金渗滤法），采用中国药品生物制品检定所提供的“血吸虫病抗体诊断试剂国家参考品”（批号：20041108）作为测定血清。其中阴性参考品由15份

9、正常人血清组成，血吸虫病抗体均为阴性，用于测定试剂盒的特异性。阳性参考品由 15份强、中、弱阳性血清组成，用于测定试剂盒对血吸虫病抗体阳性血清的检出能力。最 低阳性检出参考品为 1份血吸虫病抗体阳性样品，从1:21:16作倍比稀释，用于测定试剂盒的最低检出量（灵敏度）。诊断试剂的精密性测定由1份中等阳性血清组成，重复检测10次，用于测定试剂盒的精密性（操作方法同1 （3） d ）。结果:血清份数阴性（数）阳性（数）符合率（）阴，性参考品15150100阳性经f品15015100精密度参考品10010100火敏度经f品1:2+（1 份）1:4+（1 份）1:8羽份）1:16-（1 份）2.金标二

10、抗（试剂盒显色液原料） （1）制备方法：a.胶体金制备采用糅酸-柠檬酸钠还原法，胶体金颗粒直径为20 nm。具体方法为：取1%氯金酸5ml溶于395 ml dH2O,加热至60 C ,快速加入糅酸-柠檬酸钠溶液100 m l（1%柠檬酸三钠20 ml, 1%糅酸0.05 ml, dH2O 80 ml ),加热煮沸15 min,溶液颜色由黑逐渐变为亮红色。冷却后 用0.1 mol/L碳酸钾调溶液 pH至8.0。b.金标二抗制备二抗为亲和层析法纯化的羊抗人IgG(上海神航生物科技有限公司，蛋白浓度为3.34mg/ml,批号：IP2030)。最适蛋白稳定量选择：将待标记的二抗分别加到1ml胶体金溶液

11、中，另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入 0.1ml 10% NaCl溶液，混匀后静置2 小时观察结果，红色不变者为能使胶体金稳定的蛋白量，再加20%即为最适标记蛋白量。反应结果见下表：试管123456胶体金1ml1ml1ml1ml1ml1ml二抗0 ul1 ul1.5 ul2 ul2.5 ul3 ul10%NaCl0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml颜色蓝浅蓝灰浅红红红从反应结果观察，5号管(2.5ul)颜色未变，2.5ulX120%=3 ul,再乘以二抗的蛋白浓度3.34mg/ml ,则最适蛋白稳定量为0.01mg/ml胶体金。在500 ml胶体金溶液内加入 5

12、mg二抗，磁力搅拌 30 min ,依次加入 1% PEG20000 20ml和5% BSA 80 ml ,继续搅拌 10 min , 20 000 r/min 离心 20 min ,沉淀物用 PB 缓冲液(0.02 mol/L , pH8.0)洗涤，再以 20 000 r/min 离心20 min,沉淀物用金标稀释液(0.02 mol/L , pH8.0 TBS)稀释至 A520nm为0.8、1.0、 1.2等3种浓度，过滤除菌。(2)最适工作浓度选择：分别用以上3种浓度的金标二抗检测已包被不同浓度抗原的 检测点，根据检测点颜色深浅和背景¥#晰度判断效果，操作方法同1 (2) do

13、(3)结果：同1 (3) b, c,金标二抗浓度在 1.0时的检测效果最好，在抗原稀释度1:8(0.157mg/ml )仍可清晰显示检测点。继对“血吸虫病抗体诊断试剂国家参考品”进行测定，进一步验证了这一工作浓度的显色效果(见1 (4)。3.人IgG (试剂盒质控点原料)(1)制备方法：采用辛酸提取法，从健康献血者 5ml血清中提取人IgG。经0.22um超滤膜过滤除菌后 分装，2ul/支，置冻干机抽成干粉，-20C保存。临用时每支加工作浓度的 0.02 mol/L pH8.0 PBS 缓冲液复溶即可。(2)活性测定a.测定方法1) 取人IgG 10 l由口 190 d生理盐水作1:20稀释后

14、加入比色杯内，用分光光度计测定 A280 和 A260OD 值；2)将样品用pH9.6碳酸盐缓冲液从 1:6400起倍比稀释14个滴度，分别包被于酶标板内 (100ul/孔),37C3小时；然后倾去液体，用洗涤液洗涤3次，每次5分钟；BSA (0.5mg/ml) 为阴性对照，同法操作；3)加酶标结合物：除空白对照孔外，每孔加入酶标结合物2滴，37 c培育30分钟；4)洗板：取出酶标板，甩去孔内液体，每孔注满洗涤液洗涤5次，每次均需停留30秒后再甩净拍干；5) 显色：每孔加底物和显色剂各1滴，混匀，37 C避光反应10分钟，加终止液1滴,混匀，判断结果。b.判断依据：1) 根据公式计算：人IgG

15、浓度(mg/ml) = (1.45X A280-0.74 X A260 ) X稀释倍数；2)肉眼观察：不加终止液观察，基本无色或微蓝色为阴性，呈明显蓝色为阳性；3) 仪器判断：酶标仪上450nm读取OD值，待检样本孔的OD值大于阴性对照 2.1倍者为 阳性。c.结果：人 IgG OD 值 A280nm2.8619人 IgG OD 值 260nm 1.7831计算公式人 IgG 浓度(mg/ml) = (1.45X A280-0.74 X A260 ) X稀释倍数；人 IgG 浓度56mg/ml人IgGOD值比值人IgGOD值比值1:64002.56867551.37351:16384000.0

16、1990.3979961:128002.50180450.036071:32768000.013580.2715961:256002.11549742.309941:65536000.003660.0731981:512001.2928525.856991:131072000.009180.1835981:1024000.61812912.362581:262144000.006110.1221981:204800.3102796.2055821:524288000.005520.1103991:4096000.097321.946396BSA0.013540.27081:8192000.05

17、911.181997空白-0.00069-0.0138d.结论：原液浓度为 56mg/ml,从1:6400起作倍比稀释，经 ELISA方法检测，最低检测浓 度为1:204800(0.3 pg / ml),与抗人IgG的结合力强，可用作斑点免疫金渗滤法质控点。(3)工作浓度：人IgG的作用是作为质控点，包被于硝酸纤维素膜上，能够与金标二抗结合，产生红 色圆点，以此判断金标二抗处于有效期内；如不能出现红色圆点，则金标二抗失效。因此， 试验目的就是选择能清晰产生反应色度的人IgG浓度。a方法：1) 人IgG原液浓度测定：以0.02 mol/L pH8.0 PBS将原液作1:20稀释，用紫外分光光度仪

18、 测定 A280 和 A260OD 值，根据公式2计算浓度(mg/ml) = (1.45XA280-0.74 X A260) X稀释倍数；2) 以0.02 mol/L pH8.0 PBS 将人IgG原液从1:100至1:1000稀释成10个稀释度。3)包被：将上述10个浓度的人IgG分别点膜，在每块空白反应板中的硝酸纤维素膜(德国Schleicher & Schuell Bioscience )上点滴0.5ul,每个浓度组包被 1块，室温干燥 2小时后加入2滴封闭液，待干。4)效果测试：分别在上述 10个浓度组的金标反应板中央小孔内滴加2滴洗涤液，渗入后于滴加4滴显色液(即金标二抗，浓

19、度 1.0 (A520值)，最后加2滴洗涤液，渗入后根 据检测点颜色深浅判断效果。b.结果：1） 人 IgG 作 1:20 稀释的 OD 值：A280 为 2.8619, A260 为 1.7831 ,根据公式（mg/ml）=(1.45 X A280-0.74 X A260 ) X稀释倍数计算，原液浓度为56 mg/ml。2)检测效果金标 二抗 浓度人IgG稀释度1:1001:2001:3001:4001:5001:6001:7001:8001:9001:10001.0+土土土土注：色度判断：+深，+易见，诫c.最适工作浓度选择：人 IgG在工作浓度1:600至1:100 (约0.1mg/ml

20、0.6 mg/ml)均 能清晰显示红色圆点， 均可作为判断金标二抗是否有效的质控点。但因实际用量极微(每只反应板仅需0.5 ul),最适工作浓度选择 1:300(0.19mg/ml)为宜。参考文献1 毛守白主编.血吸虫生物学与血吸虫病的防治.北京：人民卫生出版社，1990: 465.2 现代免疫学实验技术(第二版)，湖北科学技术出版社，2002年3 丁建祖，干小仙，沈慧英，等.快速检测抗日本血吸虫抗体的金标免疫渗滤法的建立及应用J.中国寄生虫病防治杂志,1998,11 (4) :308-3104 辛晓芳，张谨，薄淑英，等.血吸虫病免疫诊断试剂的质量评价J.中国血吸虫病防治杂志,2006,18(2):119-121.附：血吸虫抗体检测质控品制备方法本品参照“血吸虫病抗体诊断试剂国家参考品”(批号：20041108)低感染度抗体水平(P13)制备，作为斑点免疫金渗滤法试剂盒出厂检验的质控品。具体方法：将2 ml血吸虫病阳性血清(江西