辐射对神经细胞移动

1、辐射对神经细胞移动     本文作者：邱 俊、蔡二朋、吴翠萍、王明明                                   单位： 安徽医科大学临床医学院放射医学研究所、安徽医科大学放射医学研究所中枢神经系

2、统因其特殊性，其辐射生物效应的研究历来受到人们的重视。国际放射防护委员会（ICRP）和联合国原子辐射效应科学委员会（UNSCEAR）曾对有关胚胎和胎儿受照影响中枢神经系统发育的人类资料和动物实验资料进行了全面综述和评论1，2，证明辐射能以损伤神经元前体细胞、影响神经元迁移及其通道分化、神经元间正确联系及神经元的分布等多种方式干扰脑发育,使其结构异常,机能发育延迟和低下。而细胞迁移涉及钙离子浓度、细胞骨架与细胞外基质变化3。本实验从细胞内游离钙离子浓度、微管和神经细胞粘附分子表达改变等角度来研究辐射对神经元细胞迁移的影响，以深入了解辐射所致脑损伤机理，为防治这种损伤提供重要实验依据。1材料和方法

3、1.1实验动物出生24小时内的SD新生鼠由安徽医科大学实验动物中心提供。1.2细胞与试剂DMEM/F12（11）和B27购于Gibco公司;bFGF、EGF、MAP2抗体购于Sigma公司；Fluo-3/AM（美国分子探针公司）；培养板（6孔、24孔、96孔，美国Falcon公司）；小鼠抗大鼠-微管蛋白（-tubulin）抗体，NCAM单克隆抗体（OBl1，Sigma公司）；HRP标记的羊抗小鼠IgG购于北京中杉金桥生物工程公司。1.3细胞的原代分离培养取新生1天SD大鼠，无菌条件下分离双侧海马，剪碎，加0.25%胰蛋白酶消化（37，30min）然后用胎牛血清终止消化；弯头滴管轻轻吹打10次，

4、以800r/min离心10min，弃上清，重新悬浮细胞，过200目筛网，调整细胞浓度为5×105/mL种植于预先涂有多聚赖氨酸的24孔板和60mm培养皿,培养基为DMEM/F12(含10%胎牛血清、2%B27，bFGF20g/mL，EGF20g/mL),置于37，5%CO2，饱和湿度的孵育箱内培养;接种第3天加入终浓度为5mol/LAra-c作用48小时,抑制神经胶质细胞的增殖。1.6神经元胞浆内游离Ca2+测定用0.25胰蛋白酶消化法制备细胞悬液。0.1mol/mLPBS洗涤2次,取细胞悬液lmL，加Fluo-3/AM至终浓度为5mol/L，置CO2培养箱，避光孵育1小时，其间轻轻

5、振荡几次。取细胞悬液，离心，弃上清。0.1mol/mLPBS洗涤3次，最后用PBS重悬至0.5mL，流式细胞仪检测，激发波长为506nm，发射波长为526nm。随机测定单个神经元的荧光强度值，取其平均值为各组测定值。实验重复3次，设4个平行样。结果以WinMDI2.9软件分析处理,利用荧光强度的大小来相对反映细胞内游离钙离子浓度的大小。1.7Westernblot检测收集HTO处理过的细胞。提取细胞总蛋白，经考马斯亮兰G-250染色法定量蛋白。灌制7分离胶和5浓缩胶，取30L总蛋白上样，经十二烷基苯磺酸钠一聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，转移到PVDF膜上，5%脱脂奶封闭；分别与一抗

6、-tubulin（1500）和NCAM单克隆抗体（1800）孵4过夜；加二抗（15000）室温孵育1小时；发光显影，定影晾干，同时以GAPDH作为内参对照。图像分析：分别对实验组的Westernblot结果进行图像扫描，各组随机抽取10张扫描图像，以GAPDH蛋白表达条带作为目的带进行IOD测定，然后根据目的蛋白表达的IOD与GAPDH蛋白表达的IOD比值作为相对量进行统计学处理。实验重复3次，设4个平行样。1.8统计学处理所得数据表示为均值±单次测量标准差，采用SPSS13.0软件进行统计分析，各组之间进行两独立样本t检验。2实验结果2.1氚辐射对神经细胞迁移的影响不同剂量氚水照后

7、8小时神经细胞迁移的距离列于表1。由表1可见，氚水浓度在03.7×106Bq/mL，神经细胞的迁移距离呈现剂量依赖性缩短,均明显小于对照（p<0.05）。2.2氚辐射对Ca2+浓度的影响照后24小时，用Fluo-3/AM标记脑海马神经元，以流式细胞仪测定细胞内荧光强度来间接反映细胞内Ca2+浓度，结果示于图1。由图1可见，随着氚水照射剂量的增大，受照细胞内荧光强度分别为42.83±6.38、55.64±9.15、58.19±7.24、80.27±9.67，均明显高于对照组（25.59±8.92，p<0.05），呈剂量依赖性

8、增加。表明加入氚水后，细胞内游离钙离子增多。2.3氚辐射对-tubulin表达的影响结果示于图2。由图2可见，随着氚辐射剂量的增大，各组细胞内-tubulin蛋白含量逐渐降低，-tubulin与GAPDH蛋白OD值之比分别为2.057±0.096、1.849±0.126、1.737±0.12、1.181±0.308、0.920±0.262。2.4氚辐射对NCAM表达的影响结果示于图3。由图3可见，随着辐射剂量的增大，各组细胞NCAM蛋白表达量逐渐降低，NCAM与GAPDH蛋白OD值之比分别为0.436±0.032、0.401±

9、;0.013、0.381±0.026、0.232±0.047、0.132±0.031。受照神经元细胞内的NCAM含量明显低于对照（p0.05）。3讨论神经细胞的迁移是神经系统发育中的一个重要环节，研究辐射影响神经细胞迁移的分子机制有助于深入了解脑辐射损伤。辐射对脑损伤的研究以前主要集中在辐射对大脑皮层和海马结构的组织、细胞及大脑内蛋白质水平的损伤效应及这些损伤与辐射所致脑机能障碍之间的关系4-6。但低剂量辐射妨碍神经元细胞迁移及其分子机制的相关资料相当缺乏，本实验通过从钙离子、细胞骨架和神经细胞粘附分子等三方面来深入研究辐射影响神经细胞迁移的相关分子机制。结果证实

10、电离辐射可使神经细胞迁移发生显著改变。电离辐射作用于神经元细胞，引起钙离子内流，从而激活一系列信号通道，引起相关分子如细胞骨架蛋白和神经细胞粘附分子的变化，影响神经元迁移。钙离子是神经细胞信息传递及神经递质合成与释放重要的细胞内第二信使。神经细胞内一定浓度的游离Ca2+对维持细胞正常的生理活动包括细胞迁移起着重要的作用。Ca2+通道有细胞溶质蛋白因此具有缓冲能力，所以Ca2+内流可在进入位点周围产生局部信号。局部信号随Ca2+内流逐渐增多而产生一系列的增大效应，以至于细胞膜系（内质网）的其他一些离子通道开放，引起胞内一系列的反应。研究发现在神经元迁移和轴突生长过程中有Ca2+的信号表达。在上皮

11、角质细胞和小脑神经元细胞迁移过程中Ca2+作用不同，故其浓度分布也迥然不同3。在其他实验中同样也发现神经元内游离Ca2+的增多，可以刺激介导神经元细胞迁移相关的细胞骨架蛋白的变化3，7。本研究发现，与对照相比，受氚水照射后细胞游离Ca2+的含量均有改变。随着照射剂量的增加，神经细胞内游离Ca2+的含量呈上升趋势。电离辐射直接作用于神经细胞，可引起Ca2+大量内流，激活钙依赖性蛋白酶（calpain），使细胞骨架蛋白降解，影响神经细胞迁移8。细胞骨架是构成细胞的物质基础，而微管蛋白是神经细胞骨架成分微管的重要组成部分，它具有神经特异性，是最早的神经元标志物之一。受照后，微管蛋白上有一些重要的与微

12、管功能密切相关的巯基基团被氧化,影响这些基团所在区域构象改变,妨碍微管聚合。同时电离辐射可诱发微管相关蛋白激酶失活，致使微管相关蛋白（MAP）磷酸化，失去结合微管的能力，因为MAP参与微管的组装及结构的稳定,当MAP被磷酸化后失去结合微管的能力,从而使微管处于不稳定状态9-12。微管构成细胞内的网状支架，支持和维持细胞的形态，是细胞骨架的主要成分之一，参与细胞分裂、迁移和极化。细胞迁移时微管被极化，促进与迁移有关物质的运输，有利于整个细胞的极化和迁移进行。资料证实，NUDF（NuclearDistributionF）人类同系物LIS1（1issencephalyprotein1）、NUDE与微

13、管或其他细胞骨架相关蛋白动力蛋白、动力肌动蛋白共同控制细胞的迁移运动13，14。本实验Westernblot结果表明，随着HTO辐射剂量的增加，神经元细胞骨架蛋白-tubulin的灰度值呈下降趋势，证实辐射影响微管蛋白表达。故电离辐射使微管处于不稳定状态，妨碍微管的聚合，从而阻止神经元细胞的迁移。NCAM属于粘附分子免疫球蛋白超家族成员之一，NCAM可以通过参与同源性(NCAM-NCAM)和异源性（NCAM和一系列蛋白包括成纤维生长因子受体、神经细胞粘附分子L1和不同类型的胶原和蛋白聚糖）细胞间相互作用来调节神经细胞轴突生长、迁移15，16。这种细胞间相互作用过程可能与成纤维细胞生长因子（FGF）受体可激活细胞内的信号传导途径有关。FGF受体上含有细胞粘附分子的同源结构域（CHD）。NCAM可能通过与CHD上的NCAM同源结构域结合来调节FGF受体活性。本研究发现神经细胞受照后，NCAM随氚辐射剂量增加而表达减少，从而影响神经细胞迁移。当电离辐射作用于神经细胞时，诱导大量Ca2+内流，激活磷脂酶C（PLC）产生甘油二酯（DAG），此时FGF受体可能受到负反馈调节作用，活性受到抑制，从而抑制神经细胞迁移15-17。