血管性痴呆大鼠海马Ng及其磷酸化水平的动态变化

1、血管性痴呆大鼠海马Ng及其磷酸化水平的动态变化陈文1, 王玉良1*，张立红2(1.潍坊医学院生理学教研室，潍坊 261042;2.济南军区总医院脊髓修复科，济南 250000)摘 要 目的：观察血管性痴呆(VD)模型大鼠海马神经颗粒素(Ng)及其磷酸化水平的动态变化，探讨Ng在VD学习记忆功能障碍中的作用及其机制。方法：采用双侧颈总动脉夹闭再灌注同时腹腔注射硝普纳建立血管性痴呆模型，在 15 d，1、2、4个月等时间点 ，采用Morris水迷宫和免疫荧光方法分别观察大鼠空间学习记忆能力及海马Ng及其磷酸化水平的变化。结果：模型组大鼠各时间点的逃逸潜伏期(EL)比假手术组均明显延长(P0.01)

2、;海马CA1区Ng 及其磷酸化Ng免疫阳性神经细胞数表达较假手术组明显减少(P0.01, P0.05) ，而且随造模手术后时间的延长，以上变化逐渐加重。齿状回仅在2个月和4个月时间点的免疫阳性神经细胞数比假手术组显著减少(P0.01, P0.05)。结论：模型组大鼠的空间学习记忆功能障碍可能与海马(特别是CA1区)的Ng及其磷酸化Ng表达水平持续降低有关。关键词 血管性痴呆;学习记忆;神经颗粒素;磷酸化;海马;大鼠Dynamic changes of neurogranin and phosphorylated neurogranin expressionsin hippocampus of

3、vascular dementia ratsChen Wen1, Wang Yuliang1, Zhang Lihong2(1.Department of Physiology, Weifang Medical University, Weifang 261042;2.General Hospital of Jinan Military Region Spinal Cord Injury, Jinan 250000, China)Abstract Objective：To observe the dynamic changes of neurogranin (Ng) and its phosp

4、horylation in hippocampal formation and their roles in learning and memory disorders in vascular dementia (VD) rats. Methods：Eighty SD rats were randomly divided into VD model group (n=40) and sham-operated (SO) group (n=40). VD models were established by repeatedly clipping the bilateral common car

5、otid arteries of the rat in combination with an intraperitoneal injection of sodium nitroprusside solution in anesthetized SD rats. Morris water maze was used to detect the changes of spatial learning and memory ability, immunofluorescent technique was used to observe the expressions of Ng and phosp

6、horylated neurogranin (p-Ng) in hippocampal formation. Results: The escape latency (EL) of model group was obviously longer than that of the SO group at different time points after VD modeling operation (P0.01); Compared with SO groups, the numbers of Ng and p-Ng positive neurons in model groups wer

7、e noticeably decreased at all time points in CA1 region (P0.01, P0.05), but decreased at only 2 months and 4 months time points in dentate gyrus (DG) region (P0.01, P0.05). Conclusion: The results suggest that the long-lasting low expression of Ng and p-Ng in hippocampal formation (especially in CA1

8、 region) may be one mechanism of resulting in learning and memory dysfunction of VD rats.Key words vascular dementia; learning and memory; neurogranin; phosphorylation; hippocampus;rat神经颗粒素(Neurogranin, Ng)是一种新发现的脑特异性神经元突触后蛋白，是蛋白激酶C的天然底物及钙调素(calmodulin, CaM)储存库1。研究表明，CaM 依赖性蛋白酶大多参与长时程增强(long term po

9、tentiation, LTP)和长时程抑制的诱导，而Ng的基因表达和蛋白质合成与神经元的突触形成、分化同步2，因此，Ng在学习记忆、神经系统发育(可塑性)等生理性变化中具有重要作用。目前，虽然有关Ng及其磷酸化水平在脑缺血再灌注损伤急性期的改变已有报道3.4 ，而且其结果并不完全一致，但在VD发病后较长时间的变化未见报道。故本实验在VD模型大鼠，采用免疫荧光化学方法，观察Ng及其磷酸化水平在VD发病中的动态变化，探讨突触后因素改变在VD大鼠学习记忆和突触传递中的作用。材料和方法1 材料健康SD大鼠，月龄34月，雄性，体重(25030) g，由解放军第89医院实验动物中心提供。将Morris水

10、迷宫筛选出较灵活的大鼠80只，随机抽取40只作为假手术组;其余40只复制VD模型。假手术组、模型组在造模后15 d，1、2、4个月等4个时间点分为4个亚组，每亚组10只，并在不同时间点进行Morris水迷宫法检测和免疫荧光检测。2 方法2.1 VD模型复制及筛选 采用重复夹闭双侧颈总动脉(CCA)同时腹腔注射硝普钠溶液方法，复制脑缺血再灌注大鼠VD模型，具体步骤见我们以前的方法5。假手术组麻醉及手术过程与模型组相同，但不阻断CCA及注射硝普钠。在术后1周进行Morris水迷宫实验(观察指标为平均逃逸潜伏期)筛选，以假手术组大鼠逃逸潜伏期均值的95%上限值为标准，将超出上限值的脑缺血再灌注大鼠确

11、定为痴呆大鼠。2.2 Morris水迷宫试验 各组大鼠分别在造模后15 d，1、2、4个月进行Morris水迷宫定位航行实验6 , 检测反映大鼠空间学习和记忆能力改变的EL。2.3 免疫荧光检测 Morris水迷宫检测后，各组大鼠麻醉后经右侧CCA向脑组织依次灌注生理盐水和4%多聚甲醛溶液，至流出液体澄清。取视交叉后4 mm处至小脑前脑组织，入4%多聚甲醛后固定12 h，常规石蜡包块，组织切片机制备脑冠状面切片，片厚约5 m。将组织切片常规脱蜡入水，山羊血清室温封闭30 min，分别滴加稀释的一抗：兔抗Ng(1:100，Upstate公司)、兔抗磷酸化Ng(1:100，Protein-tech

12、公司)和PBS空白对照(阴性对照)，再滴加生物素化羊抗兔IgG和SABC-cy3试剂，用SABC-Cy3法进行Ng和磷酸化Ng免疫荧光染色。显微镜下观察海马组织结构中目标物的表达情况。光镜下(400 ) 选取细胞数较为恒定的 CA1区中段拍片，每张照片取相同面积计数锥体细胞，3张切片的平均值为该样本的锥体细胞数。统计学处理: 所有数据均用 s 表示，应用SPSS11.5软件进行统计，采用方差分析，q检验。以P0.05为有统计学显著性差异。结 果1 行为学观测结果Morris水迷宫检测显示，与假手术组比较，模型组大鼠在15 d，1月、2月、4月各相应时间点的EL均明显延长 (P0.01)。组内各

13、时间点前后比较，模型组2月、4月时间点的EL明显长于15 d时间点(P0.05，P0.05，表1)。2 免疫荧光染色结果2.1 Ng在VD模型大鼠海马中的表达变化 荧光显微镜下，海马CA1区、CA2区、CA3区和齿状回(DG)神经元内均可见CY3标记的红色荧光免疫反应阳性产物。假手术组大鼠海马锥体细胞层和颗粒细胞层的胞浆染色亮，Ng免疫阳性神经纤维显色清晰;CA1区锥体细胞带排列紧密清晰，顶树突整齐排列于辐射层，Ng阳性荧光染色深，分布均匀。模型组大鼠海马Ng阳性细胞数减少，染色浅，神经元突起缩短或消失，细胞脱落较严重，细胞带断裂，排列分散(Fig.1)。阳性细胞计数发现，模型组大鼠CA1区各

14、时间点的Ng阳性神经细胞计数较假手术组均明显减少(P0.01);随时间点的推移，阳性细胞减少更为明显，1月、2月和4月时间点的阳性细胞计数明显少于15d时间点(P0.01)。在DG区，模型组2月和4月时间点的免疫阳性神经细胞数显著少于假手术组相应时间点(P0.01);各时间点前后比较，模型组2月和4月时间点阳性细胞计数明显少于15 d时间点(表2)。2.2 P- Ng在VD模型大鼠海马中的表达变化 各组大鼠海马切片中均可见CY3标记的红色荧光分布于神经元的胞浆及突起中，主要集中在DG、CA1、CA2及CA3，这些部位阳性细胞较密集，荧光着色深，其中以海马CA1区锥体细胞层和DG区颗粒细胞层最密

15、集，其它各层散在稀疏分布。假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞和DG区颗粒细胞P-Ng免疫反应阳性神经元排列密集，荧光着色深，有的P-Ng阳性神经细胞有较长的突起。模型组大鼠海马P-Ng阳性细胞数减少，细胞脱落较严重，细胞带断裂、排列分散(Fig.2)。阳性细胞计数显示，模型组大鼠海马CA1区各时间点的P-Ng阳性神经细胞数明显少于假手术组相应时间点(P0.05, P0.01);而且随时间点推移减少得更为明显，模型组2月和4月时间点的阳性细胞数明显少于15 d时间点(P0.05)。在DG区，模型组仅在2月、4月时间点的P-Ng阳性神经细胞数明显少于假手术组 (P0.05，表3)。Fig. 1 Ex

16、pression of neurogranin in CA1 region of hippocampus (immunofluorescent staining, 400). A: sham- operated group, B: model group (model group, 2 mouths time point).Fig. 2 Expression of phosphorylated neurogranin in CA1 region of hippocampus (immunofluorescent staining, 400). A: sham- operated group,

17、B: model group (model group, 2 mouths time point).讨 论本实验通过双侧颈总动脉反复夹闭再通结合腹腔注射硝普钠降压法复制了学习记忆障碍的VD大鼠模型。Morris水迷宫测试显示，模型组大鼠各时间点的EL均比假手术组的EL明显延长(P0.01)，提示模型大鼠学习记忆功能明显障碍。模型组大鼠各时间点前后比较，随着时间点推移EL有延长趋势，至2月和4月时间点的EL已明显长于15d时间点(P0.01)。这与赵小贞等7的研究不完全一致，可能与复制模型损伤程度有关。结合我们以前研究的结果8,9，提示脑缺血再灌注后大鼠的脑学习记忆功能损害在一定时间内是逐渐加重

18、的，到后期进展缓慢。与VD发展的慢性病程特征相符。Li等10的研究表明，大鼠脑挫伤后在受损部位表现出Ng免疫反应性的缺乏，而大脑中动脉阻塞(MCAO)可导致同侧大脑半球广泛性的Ng染色缺失。Shughrue等11在颈总动脉阻塞的缺血模型大鼠发现，缺血后大鼠海马CA1区Ng mRNA表达明显下降，考虑为该区域的神经元存在急剧的选择性缺失所致。由于Ng主要存在于神经元的树突棘上，因此，Ng可作为中枢神经系统病变时树突受损的一种标记物，Ng蛋白水平的高低可反应树突棘的密度和突触结构的可塑性。槐雅萍等3的实验结果显示MCAO术后第1 d出现Ng表达的减少，随时间推移表达逐渐增高，到第2周左右达高峰然后

19、逐渐下降。这些结果提示，Ng可能在脑缺血再灌的神经元损伤和修复中起重要作用。那么，脑缺血急性期的神经突触后Ng变化在VD慢性期的迟缓性损伤中是否也起一定的作用?目前尚未见报道。因此本实验观察了Ng在脑缺血/再灌注后的长时程改变，以探讨其在VD发病后学习记忆等慢性智能障碍中的作用。本研究采用免疫荧光计数法，分析检测各组大鼠海马齿状回分子层外带、CA1区辐射层和始层Ng阳性细胞数，结果显示：假手术组大鼠海马Ng免疫阳性神经元显色清晰;模型组大鼠于脑缺血再灌注损伤后15 d，1、2、4月海马CA1区免疫阳性细胞计数和Ng表达均低于假手术组。这些结果提示，学习记忆障碍可能主要与CA1区Ng免疫阳性神经

20、元减少和残存神经元合成Ng功能下降有关。CA1区位于信息整合、强化的最后关键脑区，脑缺血再灌注损伤时可能损伤最严重。出现这种变化的可能机制是：脑缺血再灌注损伤后, 残存神经元失代偿，出现能量代谢障碍和蛋白合成能力降低，海马细胞Ng基因转录和翻译减弱，因而Ng蛋白表达水平的降低。而Ng含量的高低可以影响神经元的再生、树突棘密度和功能，可导致神经元数量减少和缺失，突触数量和突触重建受损，突触传递功能受损，从而导致学习记忆功能障碍。本研究结果还显示，VD大鼠海马DG区分子层的Ng表达在15 d、1月时间点与假手术组无显著性差异，但在2月和4月时间点模型组Ng的表达明显低于假手术组，这与CA1区Ng表

21、达结果明显不同，提示脑缺血再灌注后海马不同脑区Ng表达对损伤有不同的反应。出现这种变化的可能机制是：脑缺血再灌注早期(15 d、1月)，由于神经元的丢失启动了机体代偿机制，如各种神经营养因子表达增多、突触重构等引起残存神经元为适应功能的需要合成代谢旺盛，从而引起残存神经元Ng表达增多;而随着脑缺血再灌注损伤后时间的延长脑损伤逐渐加重，残存神经元失代偿，出现能量代谢障碍和蛋白合成能力下降，Ng合成减少。随着神经干细胞(neural stem cells，NSCs)研究的不断深入，发现多种成年哺乳动物包括人在内的脑室下区(SVZ)和海马DG颗粒下带(SGZ)细胞终生具有分裂增殖能力，病理性刺激可以

22、激发SVZ和SGZ的神经再生12-15，这些神经生发区在脑缺血后神经的再生和损伤修复中起着重要的作用16,17。因而我们推测，脑缺血后早期大鼠SGZ的细胞增殖明显增强，并且增殖细胞部分分化为神经元和胶质细胞，从而引起Ng表达增多;而后期机体出现适应性反应，病理性刺激因素减弱，SGZ的细胞增殖明显减弱，从而出现DG区的Ng表达先期(15 d、1月)降低不明显，而后期(2月、4月)明显降低的现象。关于脑缺血后Ng磷酸化水平的改变，目前研究较少。胡俊等4的研究表明，MCAO大鼠缺血3 h Ng磷酸化水平即已呈上升趋势，随着缺血时间的延长，Ng的磷酸化水平显著升高，在缺血1 d左右即达到高峰。而本实验

23、结果显示，模型组大鼠海马p-Ng阳性神经元计数比假手术组减少，P-Ng表达也降低。这些结果的不同，可能与脑缺血后Ng磷酸化的观察时间点不同有关。出现这种变化的可能机制是：脑缺血再灌注损伤后，由于细胞内Ca2+浓度大量增加，泵功能衰竭，线粒体、溶酶体等细胞器自溶，缺血神经元发生不可逆性死亡，Ng磷酸化水平显著下降并不再恢复。脑缺血再灌注损伤后神经细胞内存在钙超载现象18，钙稳态的失衡，PKC的活化降低，从而导致其底物Ng磷酸化降低。随着脑缺血再灌注损伤后时间的延长脑损伤逐渐加重，由于氧的缺乏导致能量供应不足，进而影响到蛋白质的合成，Ng合成减少，相应的磷酸化Ng表达也减少，导致突触后信号转导障碍

24、。因此我们推测，Ng激活程度上的持续减少可能是VD发病后智能障碍持续存在的机制之一。参考文献1 Ran X, Miao HH, Sheu FS, et al. Structural and dynamic characterization of a neuron-specific protein kinase C substrate, neurogranin J. Biochemistry, 2003, 42: 5143-5150.2 Alvarez-Bolado G, Rodrguez-Snchez P, Tejero-Diez P. Neurogranin in the developme

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