艰难梭菌细胞毒素B功能区的表达

1、艰难梭菌细胞毒素B功能区的表达作者：时间：2007-11-22 11:38:00 作者：刘红升，张清华，姜泊，蒋知新【关键词】 艰难梭菌,细胞毒素B；克隆,分子；基因表达【关键词】 艰难梭菌，细胞毒素B；克隆，分子；基因表达1材料和方法1.1材料限制性核酸内切酶，T4DNAligase购自New England Biolab公司. 厌氧发生剂、脑心浸液(干粉)购自生物梅里埃公司(bioMerieux). 其他试剂为国产分析纯. 艰难梭菌（clostridium difficile, C.d VPI10463）从兰州生物制品研究所购买. 大肠杆菌菌株BL21(DE3)及质粒PET22b(+)系南

2、方医科大学消化研究所存. 1.2方法2结果2.1PCR扩增的目的基因电泳分析发现在1800 bp左右有一条带，大小与预计相符(图1). 图1琼脂糖凝胶电泳分析产物 略2.2重组质粒的鉴定将获得重组质粒命名为PET22b(+)CDB3，电泳初步鉴定结果与预期相符（图2）. 直接以PET22b(+)CDB3为模板进行测序,得到的序列，与Gene bank记录的C.d VPI10463的ToxinB3基因序列的同源性为99%. 图2目的基因的PCR产物、重组质粒和PET22b（+）载体用EcoRI单酶切的图谱略2.3重组蛋白的诱导表达经IPTG诱导后,120 g/L SDS PAGE分析表明,含有P

3、ET22b(+)CDB3宿主菌表达出Mr约为71.3103，与预期的蛋白大小相符，含质粒pET 22b(+)及无质粒的细菌则无此特异条带. 在A600 nm值为0.8，IPTG终浓度为1 mmol/L，诱导4 h时，重组蛋白的表达量最大，以可溶性蛋白为主，便于纯化. 凝胶自动扫描分析,其PET22b(+)CDB3重组蛋白占细菌周质总蛋白的34%,可溶性表达占上清的22.7%，包涵体占沉淀的25.7% (图3). 图3CDB3基因诱导表达产物的SDSPAGE分析略3讨论C.d是肠道感染中仅次于弯曲杆菌的常见致病菌，产生的毒素A与毒素B对人体造成危害，被公认为发达国家中最重要的院内感染源之一1.

4、虽然口服甲硝唑或万古霉素治疗可取得较好的疗效，但目前已存在耐药及停药后复发等问题. 疫苗接种可使高危人群获得持久和较强的免疫力，是预防与控制感染的有效措施2. C.d重组抗原的研究已见较多的报道，但多数是集中在毒素A上3，而对毒素B的研究则相对较少. Genth等4的研究将毒素B分成3个氨基酸片段：CDB1（氨基酸1546），CDB2（氨基酸 9011750），CDB3（氨基酸17512366），发现抗毒素B抗体与CDB3可以发生强烈反应，抗C.d抗体既与CDB1又能与CDB3 反应，CDB2则与两抗体均不反应. 说明CDB3是良好的抗原. 进一步实验发现，只有抗CDB3抗体才能保护完整细胞免

5、受毒素B的细胞毒性，而抗CDB1抗体只有进入细胞内才能起保护作用 . 说明该段很有可能成为制备疫苗和诊断抗原的重要候选蛋白. 故选取了毒素B羧基末端CDB3 (氨基酸17512366)进行表达，为以后的疫苗和抗原鉴定的研究建立基础. 本研究参考C.d国际标准株VPI 10463基因序列，用自行设计的CDB3引物在PCR反应中表现出较高的特异性，为理想的引物序列. 在上、下游引物中分别加入EcoRI与XhoI酶切位点，保证了读码方向的正确性. 为便于下一步的表达和纯化工作又将其装入了末端带有His标签的融合表达载体，酶切鉴定和测序结果显示获得了带有特异的CDB3基因. 蛋白电泳分析表明获得了高效

6、表达的C.d ToxinB3克隆株，本实验所表达的蛋白，与该基因编码的蛋白的分子质量大小是一致的，更进一步验证了克隆的目的基因的正确性. 因此,本研究为研制C.d重组疫苗及制备诊断试剂奠定了一定的基础.【参考文献】1Bartlett JG. Clinical practice. Antibioticassociated diarrheaJ. N Engl J Med, 2002,346(5):334-339.2SougiltzisS, KyneL, DrudyD, et al. Clostridium difficile toxoid vaccine in recurrent C.diffic

7、ile associated diarrheaJ.Gastroeterology,2005,128(3):764-770.3Ward SJ, Douce G, Figueiredo D, et al. Immunogenicity of a salmonella typhimurium aroA aroD vaccine expressing a nontoxic domain of Clostridium difficile toxin AJ. Infect Immun, 1999, 67(5):2145-2152. 4Genth H, Selzer J, Busch C, et al. New method to generate enzymaticall