苏云金芽孢杆菌晶体蛋白的制备方法

1、食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES苏云金芽孢杆菌晶体蛋白的制备方法郭艾英王硕(天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津,300222)3摘要采用了2种液体培养基、2种培养条件对3种苏云金芽孢杆菌进行培养。镜检观察当90%以上的芽孢脱落时处理菌体,经碱液裂解后比较等电点沉淀和高速离心方法提取Bt蛋白的收率和纯度。实验得出,3种菌体在1/2NB培养基,28,200r/min培养3d,蛋白产量均较高,其中HD21型菌株高达107148mg/L。高速离心得到的蛋白收率低于等电点沉淀法,但其纯度较高,满足作为抗原的条件,为ELISA检测转基因食品中Bt蛋白奠定了基础

2、。关键词苏云金芽孢杆菌,发酵,晶体蛋白,提取,电泳苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)是一类对害虫毒力强、致死速度快且对害虫天敌无毒性的昆虫病原微生物,在菌体的稳定生长期可形成伴胞晶体蛋白(parasporalcrystalprotein),又称杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalprotein,ICP)或2内毒素1,2。目前所发现的ICP可毒杀鳞翅目、双翅目、鞘翅目的害虫,此外还对膜翅目、同翅目、直翅目毛目的多种害虫及植物病原线虫控害作用3,中,Bt植物有烟草、马铃薯、甘蔗等,某。然而转基因产品是否存在生态风险、危害人体健康目前尚未有定论,为满足

3、广大消费者的知情权和选择权,有必要对转基因食品进行检测。Bt蛋白的获得是采用酶联免疫方法(ELISA)检测转Bt基因食品的关键环节,国内主要采用碱裂解法提取,该法比国外常用的不连续蔗糖密度梯度离心法简便,且提取量大5。文中采用2种常规液体培养基、2种培养条件培养菌体,并对经碱液裂解后等电点沉淀和高速离心这2种方法提取蛋白进行了比较,以期为ELISA检测转基因食品中Bt蛋白奠定基础。11211种子培养基LB培养基,NB培养基(g/L):牛肉膏5,蛋白胨10,NaCl10,调pH值712左右112122LB,蛋白胨5,Na2512g/L):牛肉膏215,蛋白胨5,Na2pH值712左右。113培养

4、条件从3种菌株的保藏斜面上分别挑取1环接种于装50mL种子培养基的三角瓶中,28,150r/min摇床培养过夜。第2天按1%的接菌量转接发酵培养基,分别按28,150r/min和28,200r/min摇床培养3d,镜检观察90%以上的芽孢脱落时停止培养。1.4Bt蛋白的提取11411菌体的碱液裂解将发酵液于4500r/min,4离心20min,沉淀用含011%TritonX2100的生理盐水洗涤,4500r/min,4离心后用无菌水洗涤3次,于4500r/min,4离心20min离心后沉淀溶于50mmol/LNa2CO3缓冲液(含1%22巯基乙醇,pH916),摇匀后于4放置2h。11412高

5、速离心法提取蛋白1材料和方法111材料取1/2菌悬液于18000r/min,4离心30min,除去菌体和其他不溶性碎片,取上清液得Bt蛋白溶液,置-20保存备用。11413等电点沉淀法提取Bt蛋白取1/2菌悬液于4500r/min,4离心30min,上清液用4mol/L乙酸钠2乙酸溶液(pH410)调pH达510左右,4沉淀4h后于12000r/min,4离心菌种:苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)HD21,HD22和HD273菌株,南开大学保藏菌种。112培养基第一作者:硕士研究生。32005年中国工业微生物研讨会获奖论文收稿日期:2005-04-238研究报告30

6、min,沉淀用无菌水洗涤数次后溶于20mmol/LTris,pH916的缓冲液中,置-20保存备用5,6。115蛋白质浓度的测定晶体蛋白质浓度的测定采用Lowry法7。116SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳采用恒流的方式将得到的Bt蛋白进行SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳。10%的分离胶,319%的堆积胶,10mA保持20min后加大电流至30mA,当染料的前沿迁移至凝胶的底部时结束。考马斯亮蓝染色10min,经脱色后观察。在芽孢旁形成菱形或双锥形的伴胞晶体,它们具有杀虫活性。对菌体饥饿培养有利于芽孢和伴胞晶体的生成。根据此特性,选用LB和NB培养基作为种子培养基得到更多有活性的菌体,1/2LB和1/2N

7、B培养基作为发酵培养基对该菌进行饥饿培养,使其利于芽孢和伴胞晶体的生成。21112摇床转速对Bt菌生长的影响苏云金芽孢杆菌是好氧菌,培养该菌要有足够的氧气来满足它们的需要,所以培养基中的溶氧量越多越利于菌体的生长。增大摇床的转速可以增加培养基中的溶氧量,从而促进菌体的生长,缩短培养时间。3种Bt菌株在相同的温度下,分别在1/2LB、1/2NB培养基和不同转速下生长3d,镜检观察的情况如表1所示。2结果与讨论211培养基和摇床转速对Bt菌生长的影响21111培养基对Bt菌生长的影响苏云金芽孢杆菌在生长的稳定期生成芽孢,同时表11/2LB,28,150r/minHD21HD22HD2731/2LB

8、,28,200r/min1/2NB,200r/min较多的芽孢,少量的晶体蛋白较多量的芽孢,部分伴胞晶体出现,较多的芽孢脱落,蛋白产生,芽孢脱落,较多的晶体蛋白产生较多的芽孢脱落,大量的晶体蛋白产生,少数晶体蛋白溶出大量芽孢脱落,大量晶体蛋白产生大量的芽孢脱落,部分晶体已溶出根据表1,速下,3种Bt1/2NB培养基上的生长周期较1/2LB培养基短,且HD21和HD273生长速度较快;用Lowry法检测等电点沉淀和高速离心2种方法提取的Bt蛋白含量,以小牛血清蛋白(BSA)作为标准物质做标准曲线,计算蛋白质产量,所得标准曲线见图1。在相同的培养基和培养温度下,摇床转速为150r/min时,菌体生

9、长缓慢,要使90%的芽孢脱落,产生更多的伴胞晶体则需要超过72h的培养时间。212Bt蛋白的提取21211碱裂解法苏云金芽孢杆菌产生的伴胞晶体是一种碱溶性蛋白,由cry基因和cyt基因所编码。在pH值高于915时大多数的cry毒素和cyt毒素溶解,少数需要在pH12时才能完全溶解。因此选用了pH916的Na2CO3缓冲液保证大多数的蛋白从菌体中溶出。21212提取方法的影响图1BSA吸收标准曲线根据回归方程计算出从每升发酵液中得到的晶体蛋白产量,数据结果见表2。表2两种蛋白提取方法所得蛋白产量mg/L提取方法1/2LB,150r/min1/2LB,200r/min1/2NB,150r/min1

10、/2NB,200r/min等沉HD21等沉HD22等沉HD273离心HD21离心HD22离心HD2739食品与发酵工业FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES由此可见,当采用等电点沉淀处理碱裂解液时,3种菌所得蛋白产率均较高,约是高速离心法的2倍,这是因为调裂解液pH值为510时,在此等电点范围内的蛋白质都会沉淀下来;3种菌在1/2NB培养基种培养得到蛋白的量高于1/2LB培养基,这与牛肉膏和酵母膏的组成成分有关;摇床的转速对蛋白质的产量也有一定的影响,但对1/2NB培养基影响较小。总的来说,HD21型菌株蛋白产量高于HD22和HD273型,最高产量达107148mg/L。而

11、HD273型菌株蛋白最高产量达101168mg/L,高于采用ZM培养基培养38h的产量(大约70mg/L)4。213Bt蛋白的分子量和纯度SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳是对蛋白质进行量条蛋白带,等沉HD273还存在有较多的杂质蛋白带,而高速离心方法得到的蛋白条带比较单一均在130kD左右。由此我们可以利用离心得到的蛋白作为抗原进行免疫大白兔获得多克隆抗体。3结论苏云金芽孢杆菌的发酵周期、晶体蛋白的产量与培养温度、时间、摇床的转速有很大关系,实验中发现,选用1/2NB培养基,28,200r/min培养3d,90%以上的芽孢都已脱落,部分伴胞晶体溶出;在蛋白质提取方面,等电点沉淀或高速离心提取Bt蛋白

12、均能得到较高的收率,其中HD21型菌株产量最高;虽然采用高速离心的方法得到蛋白收率低于等电点沉淀,但它不仅简化了实验操作程序、耗时短,而且其纯度较高。Bt蛋。:、蔡俊博士;感。参考文献化,比较及特性鉴定的一种方法。在电泳最初时间里选用10mA的小电流可使Bt蛋白在进入分离胶之前得到很好的浓缩。对每种培养条件下得到的蛋白进行电泳检测,结果见图2。图210%SDS2聚丙烯凝胶电泳图16依次为:等沉HD273、等沉HD22、等沉HD21、离心HD273、离心HD22、离心HD21所得到的蛋白从图2可以看到,3种苏云金芽孢杆菌的蛋白电泳后主要蛋白带均在130kD左右,其中3种菌在采用等电点沉淀方法提取

13、的蛋白在66kD左右都有11罗志军1Bt毒蛋白基因工程研究进展J1重庆师专学报,2000(2):89912李雪雁,李照会,许维岸1苏云金芽孢杆菌cry基因研究进展J1昆虫知识,2003,40(1):9133SchnepeE,CrickmoreN,VanRJ,MicroBiolMolBio.Rev,1998,62(3):7758064LereclusD1OverproductionofencapsulatedinsecticidalcrystalproteinsinaBacillusthuringiensisspoOAmutantJ1Bio/Technol,1995(13):67715左雅慧,丁

14、之铨,张杰1苏云金芽孢杆菌培养条件及晶体蛋白提纯方法初探J1植物保护,1999(4):32346戴经元,轩海连,孙明1用血清学方法测定苏云金芽孢杆菌晶体蛋白含量J1中国生物防治,1996,12(4):1781817JohnMWalker1TheproteinprotocolshandbookM1HumanPress,2002179ExtractionofCrystalProteinfromBacillusthuringiensisGuoAiyingWangShuo(FacultyofBiotechnology,TianjinUniversityofScienceandTechnology,Ti

15、anjin,300222,China)ABSTRACTThreespeciesofBacillusthuringiensiswereculturedattwoconditionsbytwokindsofmedium.Thethalluswasinitiallytreatedwithlysiswhen90%ofsporesleftcells,andthenwastreatedbyisoelectricpointdepositionandhigh2speedcentrifugationrespectively1ResultindicatedthattheyieldofBtproteinwasveryhighwhenthethreespecieswerefermentedin1/2NBmedium,28,200r/minfor3days,especiallyforHD21,amountto107148mg/L1AlthoughthequantityofBtproteinfromhigh2speedcentrifugationwaslowerthanthatfromiso2el