肠道病毒EV71 IgM抗体参考品的建立.docx

1、论著肠道病毒EV71IgM抗体参考品的建立范行良二高加梅'，葛胜祥七刘艳'，赵慈I,国泰'，李长贵'，徐飞海2,夏宁邵2,王军志'1.中国食品药品检定研究院，北京100050；2.国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，福建厦门361005摘要：目的建立肠道病毒EV71I&M抗体检测用参考血清盘。方法通过收集手足口病感染早期患者的咽拭子和血清，对咽拭子病毒进行分离、鉴定、基因分型，通过血清中和试验及酶联免疫吸附试验(捕获法)的验证，确定EV71IgM抗体阳性样品，组建EV71IgM抗体参考血清盘，并经3家实验室对该参考血清盘进行协同标定和确认。

2、结果12名患儿的咽拭子中均分离到EV71病毒，在RD细胞上引起细胞病变c通过套式PCR扩增、序列测定后进化树分析确认均为流行的C4基因亚型。每名患儿的双份血清均可中和EV71病毒，抗体效价为1：5121：2048。通过捕获法进行EV71IgM抗体检测结果均为阳性。以此12份样品为原料制备EV71IgM抗体阳性参考品，同时以12份EV71IgM抗体阴性血清制备阴性参考品，建立了由12份阳性参考品、12份阴性参考品、1份最低检出限参考品和1份精密性参考品组成的肠道病毒EV71IgM抗体参考血清盘。通过3家实验室协同标定，各实验室间差异均无统计学意义。结论建立了EV71IgM抗体检测参考血清盘，为相

3、关检测试剂的质员控制和评价提供了参考标准。关键词：EV71；lgM抗体；国家参考品中图分类号：R373.2文献标志码：ADOI：10.13309/ki.pmi.2014.03.003EstablishmentofthereferencepanelforEV71IgMantibodiestestingFANXing-liang*,CAOJia-mei,GESheng-xiang,LIUYan.ZHAOHui,GUOTai,LIChang-gui,XUEei-hai,XIANing-shao,WANGJun-zhi,NationalInstituteforFoodandDrugControl,Be

4、ijing100050,ChinaCorrespondingauthor:WANGJitn-zhi,E-mail:wangjzAbstract:ObjectiveTodevelopthenewnationalreferencepanelfortestingintestinalvirusEV7IIgMantibody.MethodsTheserumsamplesandthroatswabsfromHFMDpatientswerecollected,andtheswabsampleswereusedforfurthervirusisolating,identifyingandgenotyping.

5、TheEV71IgMantilxxlypositivesampleswereverifiedbyneutralizationtestandELISA(capturemethod)toestablishEV71IgMantobodypositivesamplesandconstructthenationalreferencepanel.ResultsTheEV71virusfromswabswereallisolatedin12patients.ThesevirusresultedinthepathologicalchangesofRDcells.Theisolatedviruswereconf

6、innedasepidemicG4subtypevirusbythenestedPCR,sequencingandphylogenetictreeanalysis.ThedoublesamplesfromeachpatientcouldneutralizetheEV71virus.Theantibodytitersrangedfrom1:512to1：2048,andthetestedresultsofIgMantibodiesagainstEV71viruswereallpositive.TheEV71IgMantibodypositivereferencewasdevelopedusing

7、12positiveserumsamplesasrawmaterials,andatthesametime,thenegativereferenceforEV71IgMantibodytestingwasalsodeveloped.NewnationalreferencepanelfortestingintestinalvirusEV71IgMantibodywastestedbyELISAinthedifferentlaboratories.ConclusionsThetestingpanelwassuitablefortheevaluationofIgMantibodyagainstEV7

8、1virus.ItcouldbeusedasthereferenceofEV71IgMdiagnosticreagents.ThesensitivityandaccuracyofthepanelwasinlinewiththepharmacopeiarequirementsofthenationalreferencematerialsoftheP.R.China.Keywords:EV71；IgMantibody；Nationalreferencepanel手足口病是儿童常见病，多种肠道病毒均可引起手足口病，其中肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)和柯萨奇病毒A16型(Cox

9、sackievirus16,基金项目：国家863项Q(2007BAK)7A22)作者简介：范行良，副教授，主要从事免疫学方面的研究。通讯作者:王军志,E-mail：wang)zCoxA16)最为常见。EV71导致的手足口病可引起中枢神经系统损伤，重症患者比例以及病死率均明显高于其他肠道病毒，患儿可出现脑膜脑炎、肢体麻痹和肺水肿等症状。目前EV71的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行病毒分离和病毒鉴定，如果没有采到合适的临床标本，或无法进行病毒分离,也可通过血清学检测（如中和实验）来检测血清中的中和抗体，或直接从临床标本中检测病毒的核酸来诊断。目前国内EV71IgM抗体酶联免疫诊断试剂，由于

10、生产条件不一，标准各异,试剂的灵敏度及精密性等有所差异。因此，建立统一的EV71IgM抗体诊断试剂国家参考品，对于保证EV71IgM抗体诊断试剂的质量具有重要意义。1材料和方法1.1血清样品和咽拭子从江苏、福建、吉林等地收集12例手足口病患儿血清标本，患儿的年龄16岁，病史清晰，男女各半。分两次采集，第1次采集距离发病的时间是913d,标本编号C1；第2次采集距离发病的时间是1534d,标本编号C2,共24份血清标本。咽拭子标本采集于上述感染早期患儿。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部。迅速将棉签放入装有35mL保存液的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖

11、并密封。1.2 主要试剂RD（Rhabdomyosarcoma，横纹肌瘤）细胞由中国食品药品检定研究院肠道病毒疫苗室保存并提供;EV71和CA16核酸序列扩增引物由上海生工生物工程股份有限公司合成;EV71病毒培养液由厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心提供,HRP标记的EV71单克隆抗体由北京万泰生物药业有限公司提供,无血清MEM培养基购自GIBCO公司。1.3 方法13.1病毒培养咽拭子标本保存液于4Y4000r/min离心30min,±清接种于RD细胞。37°C5%C02培养7d,连续肓传3代。1.3.2病毒基因鉴定及分型分离病毒提取RNA,套式RT-PC

12、R扩增并克隆核酸序列。为了确定病毒的核酸序列是否EV71病毒核酸序列，用EV71和CA16核酸序列中保守序列设计特异性引物对病毒核酸序列进行PCR扩增，扩增序列经测序后在GENEBANK比对以确定病毒的核酸序列，同时根据进化树对病毒的基因组进行分型。EV71核酸序列扩增引物：第一轮：C45F1（±游）：5AGAGCATGATT-GAGACACG-3'C45R1（下游）：5Z-ATCTTTCTCCTGTTTGTGT-TC3'第二轮：C45F2（上游）：5-CRGGATTAGTTG-GAGAGATAG-3'C45R2（下游）：5，-CGCAGGTGACATGAAT

13、GG-3，扩增序列长度为335bp。CA16核酸序列扩增引物：CoxA16-S（上游）：5ATTGGTGCTCCCACTA-CAGC-3'CoxA16-A（下游）：5'TCAGTGTTGGCAGCTG-TAGG.3'扩增序列长度为208bPoRT-PCR反应条件：95T,变性5min；9520s,55丁，25s,72无，40s,共35个循环;72T延伸10min。第二轮反应条件与第一轮相同，循环数为25。1.3.3中和试验将患者血清用MEM培养基梯度稀释，与分离的EV71病毒混合，加入预铺有RD细胞的96孔细胞板中，加入HRP标记的EV71单克隆抗体孵育1I】,通过计数

14、显色的细胞来测定血清中的抗体对含有EV71病毒的培养细胞抑制效率，确定血清中的IgM抗体的效价。1.3.4EV71IgM抗体检测确认实验每孔先包被抗-人IgM（抗Ji链），加入I。'稀释样品，置37弋温育30min,洗板后加入灭活EV71病毒及EV71特异性酶标抗体各50jiL,加入过氧化钠和TMB显色，硫酸终止后，测吸光值4450/630。1.3.5参考血清盘的建立将确认的12份EV71核酸阳性患儿感染早期的血清作为阳性样品，同时取12份健康人血清作为阴性样品。将一份强阳性样品S1依次2x倍比稀释分别得到S2.S3.S4样品，以病毒稀释液作为第5份样品S5,制备最低检出限系列样品。3

15、个不同实验室分别用酶联免疫吸附法对参考血清盘进行标定，标定的项目主要包括准确性（阳性符合率）、特异性（阴性符合率）、精密度（重复性）及最低检测限4个方面。1.3.6统计学分析应用SPSS16.0软件对实验数据进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析,P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1病毒的分离和签定将患儿咽拭子进行病毒培养和分离，得到12份阳性分离病毒株，并对12份病毒株进行的EV71和CA16的RT-PCR鉴定，结果显示，12份阳性标本都为EV71核酸阳性、CA16核酸阴性，见表lo对12份EV71阳性标本的核酸序列进行进一步比对，发现12份EV71病毒标本都属于C4亚型

16、，见图1。表1手足口病患儿咽拭子分离病毒株的核酸序列检测Tab.1Characteristicsofnasopharyngealswabsamplesinthereferencepanel样品号病毒分离核酸检测样品号病毒分离核酸检测EV71CA16EV7ICAI6NT-4+NT-20+NT-9.一NT-23+NT-10+NT-29.+NT-14+_NT-35NT-17NT-42+NT-18+一NT-45+注：+衣示阳性;太示阴性KMIKMIrA-AB2(M852-japanGenoTypeAGenoTypeA?A-AB204K53-japanA-BrCr-CA-7O-ETU22521B2-MS

17、-7423-B7-ETU22522-USAB3-26M-AUS-4-W-EU3648411<M)C2-NCKU9H22-AFI3M79-TaiwanC2-AF3(H45<I-TaiwanC2-AF3()445«-TaiwanC2-AF176(H4-TaiwanC4-SHZH<W-AF3O2W>-chinaC4-EU131776-Taiwan-2(K>2C2-6F-AUS-6-99-DQ381H46-AustraliCl-«04-NO-03-DQ4S2074-Norway-2003C5-EF(W>3152-Taiwan-2(MM,B3-AM

18、3965»R-Malaysia-2(M>6-B3-DQ341368-Malaysia-97B4-56W>-sin-(M>22(W-AF352027-SingaporeB4-AF316321-SingaporeC2-AF3O4457-TaiwanC4-SHZHO3-AY46S356-chinaC4-DQ13345H-Taiwan-2<HJ4C4-1235-DQ133459-Taiwan-2(MHNT-20KI<)0NT-9NT-17rNT-23r-NT-18NT-10:；<>-NT-4GenoTypeBGenoTypeC>-C4-FUYA

19、NG-EU703814-Euyang.Anhui-0804r-NT-42.NT-14R.NT-350.010.015NT-29«7INT-45图1分离的EV71病毒株的基因分型Fig.1PhylogenetictreeoftheVP1regionofEV71isolates2.2中和试验将12份EV71阳性患儿的双份血清稀释5122048倍，测中和效价进一步确认。结果显示,12份双份血清对病毒仍具有很好的抑制效果，且发病后2周的中和效价均大于等于发病后4周的中和效价，说明患儿确实感染EV71,并已产生高效价的保护性抗体，见表2。2.3EV71IgM抗体确认为了进一步对中和试验结果进行

20、验证，采用ELISA捕获法对12份血清标本的EV71IgM抗体进行进一步确认。结果显示,EUSA结果和中和试验结果较吻合;在中和试验中属于高效价的血清标本,ELISAS/CO值也相应高，见表2。提示EV71感染后中和抗体可能产生较早，2周左右即可达到峰值，随后进入平台期或开始下降。2.4参考血清盘的标定结果显示,各实验室对阳性参考品符合率及阴性参考品符合率均为100%0参考品最低检出限样品为SI、S2、S3均为阳性,S4检测结果接近于检测“灰区”，S5样品检测结果均为阴性，见图2。用SPSS软件对3个实验室最低检出限样品分别进行方差分析，各实验室间的检测结I2.<NM)KHMM)07IM

21、K)U6.(NX)由5.0003.(MK)I(MM)(HMX>llllrlllllll样品名称样品名称ii(“)10.(”)K.<XM>.5.(")4(”)3.00()2"。1.(")(HMM)*2咽拭子EV71核酸阳性患者血清标本的中和试验及IgM抗体结果Tab.2DetectionresultsofEV71IgM-positivesamples编号样品号中和试验效价IgMELISA(S/COffi)ClC2ClC2PlNT-4204851221.J4711.900P2NT-92048204816.1476.873P3NT-1020482048

22、19.54016.113P4NT-142048204818.3608.307P5NT-175125128.5203.860P6NT-182048204813.86011.487P7NT-2020482048N26.66719.687P8NT-232048204824.00015.900P9NT-292048512N26.66714.447PIONT-35204851218.5338.227PHNT-422048204821.773,26.667P12NT-45204820489.1739.740注：Cl、C2分别为第1、2次采集的血清标本;S/CO值为样品吸光值(S)与临界ffi(Cut-of

23、fCO)的比Cut-offff(=0.15PIP2P3P4P5PT>P7P8P9PIORIPI2样品名称注为阳性参考品标定结果;b：为阴性参考品标定结果;C：为jft低检出限参考品标定结果，S/CO为样品吸光值(S)与临界值(Cut-off.CO)的比值;A.B、C分别代表参加标定的3个实验室“图2EV71参考品协同标定Fig.2CollaborativeverificationofEV71IgMreferencepanelbythreelaboratories果差异无统计学意义，分别为尹=O.56(S1)、P=0.42(S2)、P=0.55(S3)、/,=0.32(S4)、二0.47(

24、S5)o3个实验室分别对精密度样品进行重复性检测，变异系数均小于15%(n=10)o3讨论EV71是小RNA病毒科肠道病毒属的成员，患儿感染后常引起手足口病症状，在临床表现上与柯萨奇病毒、埃可病毒等20多种病毒感染所引起的手足口病难以区别。近年来,EV71感染病例在亚太地区不断出现。目前EV71的发病机理尚不完全明确，临床上没有特异性的抗病毒药物和疫苗可供使用。因此，EV71感染的早期诊断对预防和控制EV71传播、尽早预防EV71感染引起的并发症和死亡的发生具有十分重要的意义。IgM抗体通常出现于感染早期。手足口病患者血清中检出EV71IgM抗体说明存在近期感染。IgM抗体检测在许多国家已成为

25、判定EV71感染的重要手段，而国内尚未建立EV71IgM抗体参考品，不能对相应的检测试剂盒进行有效的评价。实验通过收集手足口病感染早期患者的咽拭子和血清，对咽拭子病毒进行分离、鉴定、基因分型,通过血清中和试验及酶联免疫吸附试验(捕获法)的验证，确定EV71IgM抗体阳性样品，组建EV71IgM抗体国家参考品盘。并经3家实验室对参考品进行协同标定和确认。结果显示，采集到的12例患儿的咽拭子均可分离出EV71病毒，且均可引起RD细胞出现细胞病变。近年来在中国上海、重庆、浙江和深圳等多个地区分离的EV71病毒有较高的同源性，均属于C4亚型“句。通过设汁特异性的引物对所培芥的病毒进行PCR扩增、序列测定后进行进化树分析,结果表明，12份EV71病毒株都属于C4亚型，提示C4亚型EV71病毒在中国大陆可能有较广泛的分布和传播。在蛋白检测方面，首先通过中和试验对每位患儿的双份血样分别进行检测，结果显示中和效价均在1：5121：2048之间，说明EV71病毒在患儿体内均诱导产生了特异性免疫应答，产生了特异性抗体。然后采用捕获法对血清中EV71IgM抗体进行检测，检测结果均为阳性，间接证明了EV71IgM抗体的存在，相同患儿C1样品S/CO值高于C2样品，提示IgM抗体检测有助于EV71的早期诊断。以上述12份阳性样品为原料制备阳性