叶绿体分离与荧光染色观察

1、2014 年 _04_ 月 _22叶绿体分离与荧光染色观察日姓名 系年级组别 同组者科目 细胞生物学实验题目 叶绿体分离与荧光染色观察学号叶绿体分离与荧光染色观察一. 实验目的1. 通过植物细胞叶绿体的分离与纯化，了解细 胞器分离与纯化的原理和方法。2. 熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的 自发荧光和次生荧光。二. 实验原理1 叶绿体分离的原理匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗 介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒， 得到叶绿体。差速离心：颗粒在离心场中的沉降速率取决 于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬 浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一#2014 年 04 月 _

2、22日姓名 系年级组别 同组者科目 细胞生物学实验题目 叶绿体分离与荧光染色观察学号 时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速率 不同。依次增加离心力和离心时间，就能使非均一 悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在 离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组 分。叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35molL的 氯化钠或0.4molL的蔗糖溶液）中进行，以免 渗透压的改变使叶绿体受到损伤。分离过程最好 在0-5 C的条件下进行，如果在室温下，要迅速 分离和观察。2.差速离心特点：介质密度均一，速度由高到低，逐级 离心；32014 年 _04_ 月 _22日姓名 系年级组别 同组者科目 细胞生物学

3、实验题目 叶绿体分离与荧光染色观察学号用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器 ； 沉降顺序：核-线粒体-溶酶体与过氧 化物酶体内质网与咼尔基体核蛋白体， 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度 离心再行分离纯化。3. 荧光的概念光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进 入激发态，当从激发态回到基态时，可以以电磁 辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。紫外辐射、可见光及红外辐射均 可引起光致发光，如磷光与荧光。荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波 光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光 能后进入激发态，并且立即退激发在极短的时间7日姓名 系年级组别 同组者科目 细胞生物学实

4、验题目 叶绿体分离与荧光染色观察学号内能发射出比照射光波更长的光（如可见光）， 这种光就称为荧光。一旦停止入射光，发光现象 也随之立即消失。荧光分为自发荧光或诱发荧光 （次生荧光、续发荧光、间接荧光）。某些物质 受激发光照射后可直接发出荧光， 如叶绿素、血 红素的火红色荧光或木质素的黄色荧光的等，称为自发荧光（直接荧光）某些物质本身不发荧光， 但它经荧光染料染色后，再通过紫外线照射同样 也能发出荧光，这样荧光称为诱发荧光，如叶绿 体被咩啶橙染色后可发桔红色荧光。4. 荧光显微镜的操作及注意事项（1）接通电源，打开启动装置开关 ；（2）按Starter按钮3-5秒以启动激发光源。 注意Start

5、er键不能超过5秒。启动2-3分钟后2014 年 04 月 _22日姓名 系年级组别 同组者科目 细胞生物学实验题目 叶绿体分离与荧光染色观察学号 方可稳定，启动15分钟内不得关闭电源，一旦 关闭汞灯，3分钟内不得重启，用完后关闭main SWitCh ；（3）选择相对应的激发虑片、阻断虑片和双色镜。放置样品，先在普通光镜下选择好要观察的视野；（4）关闭普通光源后，撤开UV挡板，即可观察 到样品的萤光情况，需要照相时，要及时拍照， 否则可能拍不到萤光照片；（5）观察结束后，关闭 main SWitCh ,切断电 源。三. 实验材料1 .材料新鲜菠菜。11日姓名 系年级组别 同组者科目 细胞生物

6、学实验题目 叶绿体分离与荧光染色观察学号 2 试剂(1) 0.35molL 的 NaCl 等渗溶液；(2) 0.01%吖啶橙(acridine Orange )称 取0.1g吖啶橙加蒸馏水100ml做母液，储存于 棕色瓶，置4C冰箱保存。临用前取1mL母液加 1/15mol/L 磷酸缓冲液(pH4.8) 9mL3.器材普通或高速离心机(九阳豆浆机)、荧光显 微镜、研钵、滴管、漏斗、离心管，天平，量筒， 纱布。四. 实验步骤1. 选取新鲜嫩绿的菠菜叶，去叶梗及其粗脉， 洗净擦干，称取 30g放于150ml0.35M.的NaCl 溶液中；日姓名 系年级组别 同组者科目 细胞生物学实验题目 叶绿体分

7、离与荧光染色观察学号2. 将叶和液体同时装入组织捣碎机中（豆浆机 中）,匀浆 3-5min ,转速 5000rmin ;3. 将匀浆用纱布（6层）过滤于500ml烧杯中；4. 将滤液4ml在1000rmin下离心2min;5. 取上清液在3000rmin下离心5min （沉淀为叶绿体和细胞核混合物）；6. 将沉淀用2-3ml0.35M.的NaCl液悬浮；7. 取一滴悬液滴片，加盖玻片后显微镜下观察；8 另外取一滴悬液滴片，再加一滴0.01%的吖 啶橙染料混匀，盖上盖玻片，在荧光显微镜 下观察。五实验结果1 实验结果如下图所示：日姓名 系年级组别 同组者科目 细胞生物学实验题目 叶绿体分离与荧光

8、染色观察学号图1普通光镜下叶绿体形态（10× 40）2014 年 04 月 _22日姓名 系年级组别 同组者科目 细胞生物学实验题目 叶绿体分离与荧光染色观察学号图2荧光显微镜下叶绿体的自发荧 光13日姓名 系年级组别 同组者科目 细胞生物学实验题目 叶绿体分离与荧光染色观察学号图3（ 1）荧光显微镜下叶绿体的次 生荧光2014 年 _04_ 月 _22日姓名 系年级组别 同组者科目 细胞生物学实验题目 叶绿体分离与荧光染色观察学号H ° - I骨4W 41* Jt Jr r MIBfP '_JJ1£ Ml.LS T 1* ' +*4g N'

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10、学号表1叶绿体普通观察与荧光染色结果对比观 察 方 式普通光学显 微镜荧光显微镜染色后荧光 观察观 察 结 果普通光镜下， 可看到叶绿 体为绿色橄 榄形，在高倍 镜下可看到 叶绿体内部 含有较深的叶绿体自发荧 光为火红色，呈 斑状分布，其他 部分为黑色间接荧光为 橘红色，占很 少一部分，其 他大部分为 绿色17日姓名 系年级组别 同组者科目 细胞生物学实验题目 叶绿体分离与荧光染色观察学号绿色小颗粒， 即基粒。另外 还有一些其 他组织碎片结 果 分 析普通光学显 微镜下观察 到叶绿体的 正常结构。离 心不纯导致 混有其他组 织碎片叶绿体经激发 光波照射后，自 发荧光呈现火 红色，因叶绿体 在其

11、悬液中呈 现点状均匀分 布，且悬液其他 组分无自发荧 光反应，故观察 到斑状分布的叶绿体次生 荧光的来由， 橘红色为叶 绿体的荧光 效果，叶绿体 的悬液中混 有的细胞核 碎片中的核 酸经丫啶橙 染色荧光反2014 年 04 月 _22日姓名 系年级组别 同组者科目 细胞生物学实验题目 叶绿体分离与荧光染色观察学号火红色荧光效 果应呈现绿色六.1.思考与讨论 注意事项（1）要得到完整的、有活性的叶绿体，须在低 温下迅速提取，涂片后立即观察，注意离心时的 时间及强度。（2）利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观 察室，会收到许多因素的影响，如温度、光、淬 灭剂等。因此在进行荧光观察时应抓紧时间，必

12、要时应立即拍照。（3）在制作荧光显微标本时最好使用物荧光载 玻片、无荧光盖玻片香柏油。2. 思考题192014 年 _04_ 月 _22日姓名 系年级组别 同组者科目 细胞生物学实验题目 叶绿体分离与荧光染色观察学号（1）在荧光显微镜下观察叶绿体的自发荧光时， 更换滤片系统，叶绿体的颜色是否有变化？有变化。因为叶绿体的颜色取决于发出荧光能量 的高低，更换不同的滤片，激发光会不同，叶绿 体得到和辐射的能量就会不同，颜色也就会不一 样（2）游离的叶绿体和完整细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，颜色和荧光强度有无区别，为什 么？有区别。因为完整细胞内的叶绿体还要进行光合 作用，这会消耗掉一部分所吸收的光

13、，所以最后 释放的荧光能量就会比游离核糖体所释放的小， 颜色和荧光强度就会有差别。（3）根据观察到的实验现象，简述自发荧光和23日姓名 系年级组别 同组者科目 细胞生物学实验题目 叶绿体分离与荧光染色观察学号 次生荧光的区别？自发荧光指不需染色，只需在激发光照射下即可 发荧光的现象，而次生荧光需要染色。因为发光 机制不同，所用的滤光片也会不同，最后发出的 荧光颜色也会不同。（4）叶绿体分离的原理是什么？操作过程应注意什么？采用的方法是差速离心法，利用不同颗粒大小、 形状不同导致沉降速率不同，把叶绿体大小的颗 粒沉降出来。叶绿体的分离应在等渗溶液 （0.35molL氯化钠 或0.4molL蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改 变使叶绿体受到损伤；分离过程最好在 04C 的条件下进行；如果在室温下，要迅速分