蛋白质的显色反应

1、蛋白质的显色反应实验二 蛋白质的显色反应一、实验目的1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接 形式。2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 二、呈色反应1、双缩月尿反应(1)原理：尿素加热至180oC左右，生成双缩月尿并放出一分 子氨。双缩月尿在碱性条件下能与 Cif结合生成紫红 色化合物，此反应称为双缩月尿反应。蛋白质分子中 有肽键，其结构与双缩月尿相似，也能发生此反应(二 肽和氨基酸都不能发生双缩股反应)。可用于蛋白质 的定性或定量测定。反应式如下：NH2180 0c+ NH3NH2NH双缩版紫红色化合物双缩版反应不仅为含有两个以上肽键的物

2、质所有，含有一个肽键和一个-CS-NH" -CH2-NH2,-chr-nh2, -ch2-nh2-ch-nh2-ch2-oh 或-chohch2nh2 等基团的物质以及乙二酰二胺等物质也有此反应。加3也干扰此反应，因为加3与CU"可生成暗蓝色的 络离子Cu (NH3) 42+o因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩胭反应，但有双缩胭反应的物质不 一定都是蛋白质或多肽。(2)试剂尿素，10%氢氧化钠溶液，1%硫酸铜溶液,2%卵清蛋白溶液(改为蛋清溶液：水二1： 9)(3)操作4取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热 使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热， 尿素放出

3、氨，形成双缩股。冷后，加 10%氧化钠 溶液约1mL振荡混匀，再加1喻酸铜溶液1滴， 再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫 酸铜.否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。（由于杂质以及氨气的干扰，导致颜色不都是紫红 色）向另一试管加2喷口清蛋白溶液（改为蛋清溶液： 水=1 : 9）约1mL和10%（氧化钠溶液约2mL摇 匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫 瑰色的出现。2、苛三酮反应（1）原理蛋白质、多肽和各种氨基酸以及所有-氨基酸均 能发生该反应，除无a-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸 呈黄色反应外，其它均生成蓝紫色化合物，最终生 成蓝色化合物。氨、6-丙氨酸和许多一级氨化合 物都有

4、此反应。尿素、马尿酸、二酮叱嗪和肽键上O的亚氨基不呈现此度应。因此，虽不蛋白质或氨基 酸均有苗三酉底应y向好苗三酮母应塞阳性反应 的不一定都是蛋白层或城b酸。该皮应分为两步，第一步是氨基酸被氧化脱氨形成酮酸，酮酸脱竣成 醛，放出CO、NH,水合苗三酮被还原成还原型苗 三酮；第二步是所形成的还原型苗三酮同另一个水 合苗三酮分子和氨缩合生成有蓝色物质。反应机理如下：还原型荀三酮蓝紫+3H2O该反应非常灵敏，1: 150万浓度的氨基酸水溶液 即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。 但在定性、定量测定中，一方面要严防干扰物存在， 另一方面要在适宜的 PH条件下进行测定。该反应 的适宜的PH为5

5、7,同一浓度的蛋白质或氨基酸 在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚 至不显色。(2)试剂蛋白质溶液:29邮清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液(蛋清：水=1： 9),0.5%甘氨酸，0.1%苗三酮 水溶液，0.1%苗三酮-乙醇溶液。(3)操作取两支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶 液1mL再各加0.5mL0.1%苛三酮水溶液，混匀，在 沸水浴中加热12分钟，观察颜色由粉色变紫色 再变蓝色(pH不同颜色深浅不同)。在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干 后，再在原处滴一滴 0.1%第三酮-乙醇溶液，在微 火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。3、黄色反应 (1)原理含有苯环的氨基酸，如酪氨酸、色氨

6、酸，遇硝酸 后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中 进一步形成深橙色的硝酿酸钠。反应式如下NaOHHO+ HNO3 ho.O-no2nO- Na +硝基酚（黄色）O邻硝酿酸钠（橙黄色）多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以呈黄 色反应，苯丙氨酸不易硝化，须加入少量浓硫酸才 有黄色反应。试剂鸡蛋清溶液（将新鲜鸡蛋清用 6层纱布过滤， 然后按鸡蛋清：水=1: 20配制而成。大豆提取液：将大豆浸泡充分吸胀后研磨成 浆状再用纱布过滤。 头发。指甲。 0.5%苯 酚溶液。浓硝酸。0.3%色氨酸溶液。0.3%酪 氨酸溶液。10病氧化钠溶液。（3）操作向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管 出现的现

7、象，有的试管反应慢可略放置或用微火加 热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10海 氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化（14管可能需要加热)管 号1234567材 料鸡蛋 清溶 液大豆 提取 液指 甲头 发0.5%苯酚0.3%色 氨酸0.3%M氨酸浓 硝 酸4滴4滴少 许少 许4滴4滴4滴现象1现象24、考马斯亮蓝反应(1)原理考马斯亮蓝G250 (R250)具有红色和蓝色两种 色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色； 当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。它染色灵敏度高，比氨基黑高 3倍。反应速度 快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室温一小时 内稳定。在0.011.0mg蛋白质范围内，蛋白质 浓度与A595nm值成正比。所以常用来测定蛋白质 含量。试剂蛋白质溶液(鸡蛋清：水=1: 20配制而成)c 考马斯亮蓝溶液：考马斯亮蓝 G50l00mg溶于 50mL95%J享中，加100mL85%!酸混匀，配成原液。 临用前取原液15mL加蒸个留水至100mL用粗滤纸