试论化疗药顺铂对Wnt通路抑制因子的表达作用

1、试论化疗药顺铂对Wnt通路抑制因子的表达作用         【摘要】  目的 研究抗肿瘤药顺铂（cisplatin,Pt）对Wnt通路抑制因子FrpHE（frizzled relatd protein）和 DKK1（dickkopf1）表达的调节作用。方法 培养人肝癌HepG2、Hep3B、人大肠癌Lovo和人神经胶质瘤U251细胞，并分别加入5 mol/L Pt作用24 h,以RTPCR技术检测FrpHE和DKK

2、1mRNA，以流式细胞术检测肿瘤细胞中Wnt通路的关键调节因子catenin的表达。结果 顺铂作用24 h后,FrpHE mRNA表达水平在人肝癌细胞较对照组表达水平显着增加(P0.001)。在人大肠癌细胞和人神经胶质瘤细胞中，未见FrpHE mRNA表达。DKK1mRNA表达水平在加入Pt作用后的人肝癌细胞、人大肠癌细胞和人神经胶质瘤细胞均较对照组表达水平显着增加。catenin的阳性细胞百分比和平均荧光强度与对照组相比均降低（P0.001）。结论 化疗药顺铂能够诱导肝癌细胞FrpHE mRNA和人肝癌、肠癌、神经胶质瘤细胞DKK1

3、 mRNA的表达,抑制Wnt通路。  【关键词】  FrpHE；DKK1；Wnt 通路；catenin Abstract:Objective To investigate the effects of antitumordrug cisplatin on the expression of secreted frizzledrelated protein (sFRP) and 

4、Dickkopf1（DKK1）, a Wnt pathway inhibitor. Methods Human Hep3B，HepG2，Lovo, and U251 cells were transfected with antitumordrug cisplatin, catenin expression was measured by fluorescenceactivated

5、60;cell sorting (FACS) and then wnt signaling pathway inhibitor FrpHE and DKK1 expression was detected by (RT)PCR. Results FrpHE mRNA in Hep3B and HepG2 cells was initial

6、ly potentiated by antitumordrug cisplatin after 24 h, no inhibitor FrpHE was expressed in Lovo and U251, DKK1 mRNA in Hep3B, HepG2, Lovo, and U251 cells was initiall

7、y potentiated by antitumordrug cisplatin after 24 h, catenin positive cells percent and fluorescence intensity were descent. Conclusion Antitumordrug cisplatin promotes mRNA expression 

8、of wnt signaling pathway inhibitor DKK1 and FrpHE, and Wnt pathway was inhibited.  Key words:FrpHE; DKK1; Wnt signaling pathway; catenin   Wnt信号通路是一条与肿瘤有密切关系的信号传导通路，在许多肿瘤细胞中存在有Wnt信号的异常调控和过度表达。因此，

9、通过抑制Wnt通路的异常活化可能是治疗肿瘤的一条新途径。SFRP是一种分泌型糖蛋白，其与Wnt受体形成三聚体后，诱导快速的细胞内吞，减少了细胞膜上的受体，它可能与受体竞争结合Wnt蛋白，直接与Wnt蛋白结合，由此阻断了Wnt信号传导通路2。DKK是一种分泌型糖蛋白，通过作用于卷曲蛋白和散乱蛋白拮抗Wnt信号传导通路3。研究发现，外源性p53可通过诱导DKK、FrpHE抑制Wnt信号通路产生抗肿瘤的效果，Wnt信号通路很可能会作为抗肿瘤作用的一个靶点，但Wnt信号通路是否存在其它抗肿瘤药物（如化疗药物）的作用靶点，这对于阐明化疗药在肿瘤发病中所起的作用以及在肿瘤治疗中的应用非常有意义。本研究选择

10、了颇有代表性的常用化疗药顺铂，探讨其对Wnt通路抑制因子表达的影响，以了解顺铂是否通过抑制剂介导Wnt通路。  1  材料与方法  1. 1  材料  兔抗人catenin抗体和羊抗兔IgGFITC 购自博士德公司；OptiMEM培养基购于Invitrogen公司；Trizol核酸蛋白分离液购自Gibco公司； AMV酶、dNTP Mixture、Taq酶、Oligo(dT)18为大连宝生物工程有限公司产品。 Hep3B细胞：人肝癌细胞，p53缺失， 第二军医大学赵

11、健博士惠赠； U251细胞：人神经胶质瘤细胞，p53突变，上海细胞生物研究所细胞库提供；HepG2细胞：人肝癌细胞,含野生型p53,南方医科大学免疫教研室惠赠；Lovo细胞：人大肠癌细胞，含野生型p53,南方医科大学细胞生物学教研室惠赠。  1.2  细胞培养  分别加入复苏培养的HepG2、Hep3B、U251和Lovo细胞生长于10%（）胎牛血清的DMEM完全培养液中，细胞培养于37  、5%CO2培养箱中。  1.3  流式细胞术检测肿瘤细胞对 catenin表达的影响 

12、0;经顺铂作用24 h后以胰酶消化成单细胞悬液，PBS洗涤2遍后以20 g/L多聚甲醛固定30 min，离心去上清后悬于PBS+0.1%Triton100+10%山羊血清的染色液中30 min，离心去上清后加入兔抗人catenin抗体后室温孵育60 min，洗涤2次后加入羊抗兔IgGFITC室温孵育30 min后洗2遍，过400目尼龙网，上机检测1万个肿瘤细胞，以阳性细胞率（%）和平均荧光量表示。  1.4  反转录PCR  分别收集经顺铂作用24 h的细胞，按Trizol 

13、Reagent使用说明进行抽提总RNA。GAPDH引物序列：上游引物5CACAGTCCATGCCATCACTGC3，下游引物5GGTCTACATGGCAACTGTGAG3（609 bp）；FrpHE引物序列：上游引物5CCGTGC TGCGCTTCTTCTTCTGTG3,下游引物5GCGGGA CTTGAGTTCGAGGGATGG3(461 bp); DKK1引物序列：上游引物5AGGCGTGCAAATCTGTCTCG3,下游引物5TGCATTTGGATAGCTGGTTTAGT3(502 bp)（所有引物均由上海博亚生物技术有限公司合

14、成）。  1.5  RTPCR过程  按产品说明书操作，逆转录反应条件为42  ，60 min。PCR条件为： 94   2 min热启动, 94   1 min变性，58   1 min退火，72   1 min延伸，反应35个循环。  1.6  统计学方法  采用SPSS 13.0统计软件，采用

15、t检验和2检验，以P0.05为差异有显着性。  2  结 果  2.1  顺铂对肿瘤细胞FrpHE mRNA表达的影响  人肝癌细胞加入顺铂作用24 h后，FrpHE mRNA的表达较未加药物的肿瘤细胞（对照组）明显增加（P0.05）,在人大肠癌细胞和人神经胶质瘤细胞中，未见FrpHE mRNA表达，见图1。            2.2  顺铂对肿瘤细胞D

16、KK1 mRNA表达的影响  见图2，在人肝癌细胞、人大肠癌细胞和人神经胶质瘤细胞加入顺铂作用24 h后DKK1mRNA表达均较各自对照组水平明显增加（P0.05）。  Lane 1: 人肝癌细胞(野生型p53,对照组), Lane 2: 人肝癌细胞(野生型p53,加顺铂), Lane 3: 人大肠癌细胞(对照组),Lane 4: 人大肠癌细胞(加顺铂), Lane 5: 人肝癌细胞(p53缺失，对照组), Lane

17、 6: 人肝癌细胞(p53缺失，加顺铂), Lane 7:人神经胶质瘤细胞(对照组), Lane 8: 人神经胶质瘤细胞(加顺铂)  Lane 1: 人肝癌细胞(野生型p53,对照组), Lane 2: 人肝癌细胞(野生型p53, 加顺铂), Lane 3: 人大肠癌细胞(对照组),Lane 4: 人大肠癌细胞(加顺铂), Lane 5: 人肝癌细胞(p53缺失，对照组),&#

18、160;Lane 6: 人肝癌细胞(p53缺失，加顺铂), Lane 7:人神经胶质瘤细胞(对照组), Lane 8: 人神经胶质瘤细胞(加顺铂)  以上结果显示，加入化疗药后在不同的肿瘤细胞中对Wnt通路抑制剂FrpHE mRNA和DKK1mRNA表达具有上调作用，为了进一步观察FrpHE和DKK1上调后是否对Wnt通路产生抑制作用，本实验进一步观察了Wnt通路的关键因子catenin表达水平的变化。  2.3  人肝癌细胞HepG2、人大肠癌细胞Lovo、人神经胶质瘤细胞

19、U251、人肝癌细胞Hep3B中加入顺铂后catenin的表达  如图3、4、5、6所示，加药24 h后，在肿瘤细胞中catenin的阳性细胞百分比强度与对照组相比表达水平降低（经2检验，P0.05）。  3  讨 论   Wnt通路是在胚胎发育、中枢神经系统形成中起关键作用的信号传导通路，与肿瘤有着密切的关系，其通路的异常活化参与人类多种癌症的发病过程，DKK和FrpHE是Wnt信号通路的抑制剂，因此，抑制或阻断Wnt通路的异常活化有望成为抗肿瘤治疗的新靶点。  本研究结果显示：抑制剂DKK1mRNA表

20、达水平在人的肝癌细胞、人大肠癌、人神经胶质瘤细胞中，24 h后与对照组相比表达水平明显升高。FrpHE mRNA表达水平在人的肝癌细胞中，24 h后与对照组相比表达水平明显升高。这说明顺铂能够上调DKK和FrpHE，对FrpHE和DKK1有显着的诱导作用。表明顺铂不仅直接抑制DNA复制，还可通过抑制Wnt通路产生抗肿瘤的作用，顺铂诱导FrpHE和DKK1，很可能是它们抗肿瘤作用的其中一种方式。因此，研究化疗药的抗癌作用新机制是一项非常有意义的工作，通过对新作用环节的研究，不仅可以弄清化疗药的作用，更好地运用它们来治疗恶性肿瘤，进一步探寻抗肿瘤的新靶点，为研究抗肿瘤

21、新药提供新靶点和新依据。  异常Wnt通路致癌关键是胞浆内游离的变异catenin蛋白积聚进入细胞核，促进靶基因无限制转录，肿瘤细胞增殖7-9。本结果显示，加入化疗药顺铂后，在不同的肿瘤细胞中，catenin的阳性细胞百分比强度和平均荧光量逐渐下降（见图3-6），说明化疗药物对catenin起下调作用，能够诱导Wnt通路抑制剂FrpHE、DKK1的表达。  实验还发现，大肠癌细胞株Lovo及神经胶质瘤细胞U251并没有FrpHE的表达，说明它们可能是FrpHE缺失型的肿瘤细胞株。其他学者也报道了在乳腺癌、肺癌中有近半数存在FrpHE的缺失10，而且FrpHE的缺失常伴有ca

22、tenin的异常积聚。结合Wnt信号通路异常与肿瘤发生的关系，提示FrpHE在肿瘤的发生过程可能是一个很关键的因素。 【参考文献】  1 POLAKIS P. Wnt signaling and cancer J.Genes Dev,2000,14:1837-1851. 2 KAWANO Y,KYPTA R. Secreted antagonist of the Wnt signaling pathway J.Journal of Cell Science,2003,116(Pt13):2627-2634. 3 CHENG J H,SHE H,HAN Y P，et al. Wnt antagonism inhibits hepatic stellate cell activation