高效液相色谱-荧光检测流速梯度法测定去卵巢小鼠脑内单胺类神经递质.docx

1、2005年1月January2005色谱ChineseJournalofChromatographyVol.23No.17678高效液相色谱荧光检测流速梯度法测定去卵巢小鼠脑内单胺类神经递质张雷，卢英俊，邓同乐，郑筱祥(浙江大学生物医学工程系，浙江杭州310027)播要：建立了同时检测去卵巢(OVX)小鼠脑内的去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5羟色胺(5-HT)3种神经递质的高效液相色谱方法。采用的色谱条件为：G,柱分离.荧光检测器检测，流动相为0.1mol/L的KH2PO4缓冲液-甲醇(体积比为9：1),设置单泵流速梯度洗脱。方法的检测限(S/N=3)均在10nmol/L以下，绝对回收

2、率均在80%以上，样品日内测定蜂面积的相对标准偏差在3.03%以下。该方法具有检测灵敏度高、样品制备简便等优点.对小鼠脑内的3种单肢类递质的检测具有实用价值。关键词：高效液相色谱；流速梯度；去甲肾上腺素；多巴胺;5-羟色胺；去卵巢小鼠中图分类号：O658文献标识码：A文章编号：1000-8713(2005)01-0076-03MeasurementofMonoamineTransmittersintheBrainsofOvariectomizedMiceUsingHighPerformanceLiquidChromatographywithFluorescenceDetectionandGra

3、dientFlowRateElutionZHANGLei,LUYingjun,DENGTongle,ZHENGXiaoxiang(DepartmentofBiomedicalEngineeringofZhejiangUniversity,Hangzhou310027,China)Abstract:Amethodforthedeterminationofnorepinephrine(NE),dopamine(DA)and5-hydroxytryptamine(5-HT)inbrainsofovariectomizedmicewasestablishedbyusinghighperformance

4、liquidchromatographwithafluorescencedetector,aC18columnandagradientflowratedeliveredbyasinglepump.Themobilephasewasamixtureof0.1mol/LKH2PO4andCHjOH(9/1,v/v).Detectionlimitsofthemethodweredeterminedtobelowerthan10nmol/L,absoluterecoverieswereabove80%andtherelativestandarddeviations(RSDs)ofintra-daywe

5、reallwithin3.03%.Themethodhastheadvantagesofhighsensitivityandofsimplesamplepreparation.Shortanalysistimeandbetterseparationofsampleswerealsoobtained.Keywords:highperformanceliquidchromatography；gradientflowrate；norepinephrine；dopamine；5-hydroxytryptamine；ovariectomizedmice单胺类神经递质在中枢神经系统中参与脑缺血、镇痛、学习

6、记忆等多种生理过程.具有重要的生理意义。该类神经递质包括儿茶酚胺和呼噪胺等.前者主要指去甲肾上腺素TNE）和多巴胺（DA）,后者主要指5-羟色胺（5-HT）。国内关于NE,DA和5-HT3种神经递质的检测多采用高效液相色谱-电化学分析法（HPLC-ECD）CS，但由于ECD对流动相变化较为敏感，故较少采用梯度洗脱。梯度洗脱中以流动相的浓度变化最为常见，而以流动相的流速梯度的应用在文献中少有报道。本文采用高效液相色谱-荧光检测法，尝试设置单泵流速梯度洗脱，同时检测了NE,DA和5-HT,样品的洗脱时间得到明显缩短。1材料和方法1.1仪器和试剂岛津LC-10Atvp系列：RF-10AXL荧光检测器

7、，LC-10Atvp高压泵，Rheodyne7725进样阀。Heraeus公司Labofuge400R冷冻离心机。DA,5-HT,NE和磷酸二氢钾（KH2PO4）均为Sigma公司收稿日期：2004-02-04作者简介：张雷.男，硕士研究生，E-mail：zl78213.通讯联系人：郑筱洋.女.教授.博士生导主要从事系统与定量生理学研究,E-mail；z6>.第1期张雷等：高效液相色谱法-荧光检测流速梯度法测定去卵巢小鼠脑内单胺类神经递质77产品；甲醇为国产HPLC色谱纯，高氯酸和盐酸为国产分析纯。12标准品和脑匀浆样品的制备准确称取标准品NE4.23mg,DA47.40mg,5-HT5

8、3.18mg,分别溶于0.1mol/LHC1中，并定容于25mL容量瓶，制成标准品储备液（NE5mmol/L,DA10mmol/L,5-HT10mmol/L）o再按需要用0.1mol/LHC1稀释成各种浓度的标准液。脑匀浆样品的制备：小鼠直接断头，在冰台上剥离出小鼠全脑（保留大脑及间脑），称重。按0.1g脑（湿重）加入1mL5%高氯酸的比例加入高氯酸，放入玻璃匀浆管内，冰浴下匀浆。将匀浆液收集于1.5mL离心管中，于13000r/min下低温离心20min,取上清液进样检测。13色谱条件Shim-pack柱，6.0mmi.d.x150mm,5m；流动相：0.1mol/L的KH2PO4缓冲液-甲

9、醇（体积比为9：l）o单泵流速线性梯度程序：0.510min2.5minmL/min1mL/min1.5mL/min（保持18min）*0.5mL/min；进样环体积为20|xL；柱温为室温；荧光检测器的激发波长为254nm,发射波长为338nm02实验结果2.1线性范围和检测限采用外标法，以不同浓度的标准液进样测定，以峰面积丫为纵坐标、进样浓度X（”nol/L）为横坐标作图，计算出线性回归方程（如表1）。以S/N=3汁得到方法的最低检测限分别为：NE5nmol/L,DA10nmol/L,5-HT5nmol/Lo衰1NE.DA和5-HT的城性回归方程Table1Regressionequati

10、onsofNE,DAand5-HTy：Peakarea；X：concentrationofsample,“mol/L.CompoundLinearrange/(|imol/L)Regressionequation*rNE0.05-20Y=547740X+4302.80.9999DA0.10-25Y=379769X0.98915-HTO.OO5-I.2F=8x!06X0.99972.2色谱分离和保留时间标准液和脑匀浆样品中的NE,DA和5-HT的峰之间分离较好（样品中NE与杂质峰的分离尚有待改善），保留时间分别在5,7和12min左右。脑匀浆中的各种杂质峰均在20min内洗脱完毕，且杂质峰对结果

11、无干扰。色谱图见图1和图2（由于生物样品的日间变异因素，个别物质在不同样品中的保留时间稍有出入）。图13种神经递质标准液的色谱图Fig.1Chromatogramofthemixtureofthreestandards图2脑勾浆样品色谓图Fig.2Chromatogramofabrainsampleofovariectomizedmice2.3回收率的测定将混合标准液定量地加入5份未处理过的脑匀浆样品中，进样后测定，结果见表2。衰2NE,DA和5-HT的回收率测定（n=5）2.4方法的精密度Table2DeterminationofrecoveryofNE,DAand5-HT(n-5)Comp

12、oundAdded/(p.mol/L)Found/(p.mol/L)Recovery(5±SD)/%NE0.54390.464885.45±2.431.08780.922584.80±1.811.63171.417286.85t1.33DA0.33240.318695.86±3.660.66480.642996.71±1.420.99720.967997.06±0.895-HT0.25320.213784.38t1.790.50640.424183.74i1.370.75960.643284.68±2.27连续测定混合标准液

13、6次，NE,DA和5-HT的峰面积日内测定的相对标准偏差分别为1.83%,1.18%和3.03%。2.5样品测定应用所建立的方法对双侧去卵巢（OVX）一个月后的小鼠脑内的单胺类神经递质进行测定，并-78-第23卷与对照组进行比较（结果见表3）,发现小鼠在去卵巢一个月后，由于体内雌激素水平下降，脑内DA的含量比对照组显著性升高（P<0.01）,而NE和5-HT的含量变化却没有显著差异。衰3去卵M(OVX)小M脑内NE,DA和S-HT水平的变化Table3ChangeofthelevelsofNE,DAand5-HTinthebrainsofovarlelomized(OVX)miceg/g

14、CompoundOVX(x±SD)Control(x±SD)(n=8)(n=11)NE3.84±0.443.97±0.54DA2.35±0.56,1.7110.255-HT0.6110.100.62±0.10Note：P<0.01vscontrol.3讨论据研究，许多疾病的发生和体内的雌激素水平有密切关系，如阿尔茨海默病（AD）、帕金森氏病（PD）等，其中的机制之一就是影响了中枢单胺能神经特别是多巴胺（DA）系统的功能'。本实验采用岛津Cm柱，用荧光检测器测定了小鼠双侧去卵巢后脑内单胺能神经递质的变化。由于NE和DA出峰

15、较早,5-HT的出峰时间较为拖后，故采用梯度洗脱；又由于NE在流动相流速较高时不易与杂质峰分离，故在设置单泵流速梯度时，开始阶段调低流动相流速，使NE充分分离，而后提高流动相流速，使5-HT较快出峰，并使更多的杂质较快洗脱。.本方法不仅灵敏度高，特异性强，而且使整个样品的洗脱时间较短，可用于血液、体液等生物样品中NE,DA和5-HT的测定。参考文献：1XuShaofen.Neurobiology.2nded.Shanghai:ShanghaiMedicalUniversityPress(许绍芬.神经生物学.第2版.上海：上海医科大学出版社)1999.119(2：TangAiguo.WuHong

16、,GaoJiesheng.YangXilan.ChineseJournalofChromatography(唐爱国，吴表，高洁生，播锯兰.色谱)1995.13(6)：4723 WangLili,GuoZhian,ZhaoDehua,MetQibing.ChineseJournalofChromatography(王莉莉.郭治安，赵德化，梅其炳.色谱).1999.17(2)：223HuangTichua,KissingerPT.ChineseJournalofAnalyticalChemistry(黄铁华.KissingerPT.分析化学).1998.26(6)；7484 QuZhiwei,LiuYun,ZhangJuntian.ActaAcademiaeMe-dicinaeSinicae(屈志炜.刘云.张均HL中国陕学科学院学报)，1987,9(5)：371MuraiS,SaitoH.MasudaY,ItohT.JNeurochem,1988,50(2)：4737NieWei,ZhangYongxiang.ChineseJournalofPharmacologyandToxicology(伟，张永祥.中国药理学与毒理学杂志).2001,15(5):3