药品检验中实验菌种的保存

1、GUOJIYIYAOWEISHENGDAOBAO 医学学术版临床检验经本文实验研究发现1000名药厂职工白细胞分类计数时各类白细胞的分布高峰分别是中性粒细胞(N范围在50.1%75%之间的占81%,淋巴细胞(L范围在20% 40%之间的占72%,单核细胞(M范围在3-8%之间的占81%,嗜酸性粒细胞(E范围在0.5%5%之间的占84%,嗜碱性粒细胞(B范围在0%0.5%之间的占52%;各类细胞的次分布高峰分别是中性粒细胞(N范围在40%50%之间的占17%,淋巴细胞(L范围在40%50%之间的占24%,单核细胞(M范围在8%12%之间的占13%,嗜酸性粒细胞(E范围在0.5%5%之间的占84%

2、,嗜碱性粒细胞(B范围在0.5%1%之间的占32%;由附表可见本厂职工血常规体检表明白细胞各类细胞的分布范围是中性粒细胞(N范围在40%75%之间共占98%,淋巴细胞(L范围在20% 50%之间共占96%,单核细胞(M范围在3%12%之间共占94%,嗜酸性粒细胞(E范围在0.5%8%之间共占92%,嗜碱性粒细胞(B范围在0%2%之间共占98%;所以对1000名药厂职工血常规体检后,可以推断其各类白细胞的特殊范围是中性粒细胞(N范围在40%75%之间,淋巴细胞(L范围在20-50%之间,单核细胞(M范围在3%12%之间,嗜酸性粒细胞(E范围在0.5%8%之间共占92%,嗜碱性粒细胞(B范围在0%

3、2%之间,比较全国临床检验操作规程(第二版参考值范围4,具体说明即是中性粒细胞(N下限范围降至40%,淋巴细胞(L上限范围提升到50%,单核细胞(M上限范围提高至12%,嗜酸性粒细胞(E上限范围上升为8%,嗜碱性粒细胞(B的上限范围也升到了2%;这些分类特征即是药厂职工白细胞分类的特殊性,同时其分类的分布范围与正常分类范围有着很大部分的交叉,亦为药厂职工白细胞分类的普遍性。当然CD3700全自动5分类血细胞分析仪在某种意义上来讲也只是起到一个过筛作用,而且文中研究对象有数量和区域等方面的局限性,正如相关文献所述,凡仪器白细胞分类计数结果正常及WBC、Hb、PC这三项参数正常的和散点图、直方图无

4、异常提示者,可不必手工分类,减少手工复片数量,从而提高工作效率。凡WBC、Hb、PC任一项异常者,虽白细胞分类结果正常,也需涂片镜检;白细胞分类结果中任一项有异常的,尤其是B、M、ALY、LIC异常增高时,必须手工复检;血液病及黄疸病人的血标本也需手工分类。掌握以上几点才能既保证检验质量,又提高工作效率,从而更好地为临床提供可靠的诊断依据5。不过,我们通过特殊也更了解了普遍,白细胞分类存在地域和工作环境等因素的影响,一定要具体情况具体分析。参考文献3郭建华,周有利,冯景等.CELL-DYN3700血液细胞分析仪在白细胞分类计数中的应用评价.中国误诊学杂志, 2005,5(2:2862875赵亚

5、娟.ABXPENTRA-60血细胞分析仪白细胞分类的实验室评价.实用医技杂志,2005,12(2:341(责任编辑:谢丹实验菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料,也是微生物有关的生产部门的重要生产资料。故而在长期从事生产、科研、教学和医疗防疫的实际活动中,人们获得了很多宝贵而实用的各种实验菌种。微生物具有生命活力,其世代时间一般很短,同时微生物具有容易变异的特性,在传代过程中易发生变异甚至死亡。因此,实验菌种的保存是一项重要的基础工作,是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要部分。1实验菌种保存的目的和意义1.1实验菌种保存的目的实验菌种保存的主要目的就是广泛收集的各种具体有利用价值的微

6、生物菌种选择最适宜的保存方法,避免在保存期间和传代过程中死亡、变异、衰退及微弱,以保持菌种原有的各种生物学特征,从而达到保证研谈药品检验中实验菌种的保存与管理王莉莉江门市药品检验所广东江门529000摘要实验菌种是从事微生物学及生命科学研究的重要材料,实验菌种的保存与管理是药品检验中的一个关键的环节,本文综述了药品检验中实验菌种的保存及复壮方法,并论述了实验菌种保存的意义和目的。关键词实验菌种保存管理定期检查复壮153I M H G NINTERNATIONALMEDICINE&HEALTHGUIDANCENEWS究、检验、交换和使用的目的。1.2药品检验中实验菌种保存的意义实验菌种的

7、保存是药品微生物检验工作中的一项关键技术。药品中的控制菌检查使用的阳性对照菌需要通过妥善的保存以防止因多次传代而使阳性对照菌和典型生物学特征发生变化及菌株死亡。另外药品微生物检查过程中,发现的可疑致病菌应该通过妥善的方法保存,以便进一步鉴定,保证用药安全1。2实验菌种保存的管理程序实验菌种的保存必须有关于每一种菌种的详细记录及有关实验资料。一般是首先填写菌种卡片,登记菌种名称编号、来源历史、形态特征、培养特征、生化及血清学鉴定以及菌种的传代次数、最适宜的培养条件、保存方法等;然后交由专人保存,并定期检查菌种的存活率、菌株纯度及其有关特征。3实验菌种保存的方法实验菌种在保存过程中,必须使微生物的

8、代谢处于最不活跃或相对静止的状态,这样才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素,所以,实验菌种的保存方法大都是根据这三个因素而设计的。3.1斜面低温保存法:将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上,待菌充分生长后,棉塞部分用油纸包扎好,移至28的冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而有不同,霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存24个月,移种1次。酵母菌2个月,细菌最好每月移种一次。此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法,优点是操作简单,使用方便,不需特殊设备,能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异,因为培养基的物理、化学特

9、性不是严格恒定的,屡次传代会使微生物的代谢改变,而影响微生物的性状;污染杂菌的机会变较多。3.2液体石蜡保藏法(1将液体石蜡分装于三角烧瓶内,塞上棉塞,并用牛皮纸包扎,0.5kg/cm2>, 121.3灭菌30分钟,然后放在40温箱中,使水汽蒸发掉,备用。(2将需要保藏的菌种,在最适宜的斜面培养基中培养,使得到健壮的菌体或孢子。(3用灭菌吸管吸取灭菌的液体石碏,注入已长好菌的斜面上,其用量以高出斜面顶端1cm为准(图-12,使菌种与空气隔绝。(4将试管直立,置低温或室温下保存(有微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长。此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死,酵母菌可保

10、藏12年,一般无芽孢细菌也可保藏1年左右,甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌,在37温箱内,亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单,不需特殊设备,且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置,所占位置较大,同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养移种后,接种环在火焰上烧灼时,培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅,应特别注意。3.3滤纸保藏法(1将滤纸剪成0.5cm×1.2cm 的小条,装入0.6cm×8cm的安瓿管中,每管12张,塞以棉塞,1.05kg/cm2>,121.3灭菌30分种。(2将需要保存的菌种,在适宜的斜面培养基上培养,使充分生长。(3取灭菌脱脂牛乳12ml滴加

11、在灭菌培养皿或试管内,取数环菌苔在牛乳内混匀,制成浓悬液。(4用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条侵入菌悬液内,使其吸饱,再放回至安瓿管中,塞上棉塞。(5将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中,用真空泵抽气至干。(6将棉花塞入管内,用火焰熔封,保存于低温下。(7需要使用菌种,复活培养时,可将瓿管口在火焰上烧热,滴一滴冷水在烧热的部位,使玻璃破裂,再用镊子敲掉口端的玻璃,待安瓿管开启后,取出滤纸,放入液体培养基内,置温箱中培养。细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏,前两都可保藏2年左右,有些丝状真菌甚至可保藏1417年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便,不需要特殊设备。3.4沙土保藏法(1取河沙加入1

12、0%稀盐酸,加热煮沸30分钟,以去除其中的有机质。(2倒去酸水,用自来水冲洗至中性。(3烘干,用40目筛子过筛,以去掉粗颗粒,备用。(4另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土,加自来水浸泡洗涤数次,直至中性。(5烘干,碾碎,通过100目筛子过筛,以去除粗颗粒。(6按一份黄土、三份沙的比例(或根据需要而用其他比例,甚至可全部用沙或全部用土掺合均匀,装入10mm×100mm的小试管或安瓿管中,每管装1g左右,塞上棉塞,进行灭菌,烘干。(7抽样进行无菌检查,每10支沙土管抽1支,将沙土倒入肉汤培养基中,37培养48小时,若仍有杂菌,则需全部重新灭菌,再作无菌试验,直至证明无菌,方可备用。(

13、8选择培养成熟的(一般指孢子层生长丰满的,营养细胞用此法效果不好优良菌种,以无菌水洗下,制成孢子悬液。(9于每支沙土管中加入约0.5ml(一般以刚刚使沙土润湿为宜孢子悬液,以接种针拌匀。(10放入真空干燥器内,用真空泵抽干水分,抽干时间越短越好,务使在12小时内抽干。(11每10支抽取1支,用接种环取出少数沙粒,接种于斜面培养基上,进行培养,观察生长情况和有无杂菌生长,如出现杂菌或菌落数很少或根本不长,则说明制作的沙土管有问题,尚须进一步抽样检查。(12若经检查没问题,用火焰熔封管口,放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况。(3需要使用菌种,复活培养时,取沙土少许移入液体培养基内

14、,置温箱中培养。此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、放线菌,因此在抗生素工业生产中应用最广,效果亦好,可保存2年左右,但应用于营养细胞效果不佳2。3.5液氮冷冻保藏法:(1准备安瓿管用于保藏的安瓿管,要求能耐受温度突然变化而不致破裂,154国际医药卫生导报GUOJIYIYAOWEISHENGDAOBAO因此,需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管,安瓿管的大小不一通常使用75mm×10mm的,或能容1.2mm液体的。(2加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢等容易分散的细胞时,则将空安瓿管塞上棉塞,1.05kg/ c m2,121.3灭菌15分钟:若作保存霉菌菌液,加入量以能浸没以后加入的

15、菌落圆块为限,然后再用1. 05k g/c m2>,121.3灭菌15分钟。(3接入菌种将菌种用10%的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液,装入已灭菌的安瓿管;霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器,从平板内切取菌落圆块,放入含有保护剂的安瓿管内,然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。(4冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降1的慢速冻结至-30。若细胞急剧冷冻,则在细胞内会形成冰的结晶,因而降低存活率。(5保藏经冻结至-30的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内,然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150,液态气氮内为-196。(6恢复培养保藏的菌种需要用时,将安瓿管取出,立即放入3840的

16、水浴中进行急剧解冻,直到全部融化为止。再打开安瓿管,将内容物移入适宜的培养基上培养。此法除适宜于一般微生物的保藏外,对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏,而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。4实验菌种的定期检查及复壮4.1定期检查定期检查是实验菌种保存与管理的最基本的内容之一,通过定期检查可以考察菌种的存活情况、形态特征、生理生化特征是否异常,以及保存技术的有效性等。定期检查应常观察保存菌种的外观、干燥情况、真空度等保存状况,除此还须将菌种管开启境况复活。4.2菌种的复壮实验菌种经过多次人工传代培养和保存,可能会由于自发

17、突变的作用而引起某些优良特性变弱活消失,这就是实验菌种的衰退,使衰退的实验菌种重新恢复原来的优良特性,称为复壮。复壮包括两方面的内容:一是将衰退的菌种通过分离和生物学特性的测定,找出未衰退的个体;二是菌种自发突变但尚未衰退前,有目的地进行菌种的分离和测定,以期找到比原来的菌种性能更优良的菌株。常用的复壮方法有:分离纯化法、通过宿主复壮、淘汰退化、理化因素诱变等。通过各种方法复壮的菌种必须经过形态特征、生理生化特性、代谢产物、血清学等一系列实验鉴定,证明复壮前后与原菌种完全一致方可认为菌种已被复壮,否则只能认为是变异型菌株。实验菌种的保存与管理应该按照严格的管理制度执行,同时还应注意实验室的安全防护及菌种的使用处理,只有严格按照实验操作规程来进行实验菌种的管理,才能保证实验菌种的安全、有效,更好地为实验服务。参考文献1马绪荣,苏德模.药品微生物学检验手册M.北京:科技出版社,2000:4502高树德,汪美先.防疫检验手册(第1版M.北京:科技出版社,1982:269(责任编辑:谢丹医学学术版临床检验菌种的保存是医学微生物学实验室的重要工作,常用保存方法主要有:定期移植保存法、冷冻真空干燥法。这些保存方法各有优缺点,定期移植法操作简单,不需特殊设备,但保存时间不长,易污染杂菌,因反复传代容易发生变异1;冷冻真空干燥法虽有保存时间长的优点,但操作复杂,