老年性痴呆动物模型的研究进展

1、老年性痴呆动物模型的研究进展         11-03-09 13:25:00     作者：凌雁武，黄瑞雅    编辑：studa20【关键词】  老年性痴呆；动物模型 老年性痴呆又称阿耳茨海默病（Alzheimer's disease，AD），是一种严重危害中老年人身心健康的神经系统退行性疾病，其临床表现为进行性记忆力减退和智力下降，主要神经病理特征是大脑皮质萎缩、神经细胞丧失，细胞外存在大量由淀粉样蛋

2、白（amyloid；A）组成的老年斑（Senile  Plaques；SP）、神经细胞内神经纤维丝缠结（Neurofibrillary tangles；NFTs）以及皮质动脉和小动脉的血管淀粉样变性。因AD病因病理的多样性、异质性和复杂性使建立理想的AD动物模型面临巨大的困难和挑战，但近年AD研究者采用各种方法开展AD模型的研制与应用，取得了一定成果，特别是AD转基因动物模型应用成就更是令人瞩目，本文就AD模型作一综述。衰老动物模型    自然衰老鼠的形态学观察可见鼠脑隔区、斜角带核及Meynert基底核中的神经元萎缩、丧失，同时表现有感觉、运动及学习记

3、忆等多种功能的下降，这些改变与人类AD有相似之处。自Takeda T首次报道快速老化小鼠（Senescence  accelerated  mouse/prone,SAMP）后，快速老化小鼠作为一个较理想的衰老模型目前已在许多国家广泛应用，其中SAMP8(prone/8)亚系既有自然衰老小鼠的特征，又有类似老年性痴呆的脑部病理及学习记忆功能衰退。与AD相关基因如载脂蛋白E,糖皮质激素a受体及盐皮质受体mRNAs水平在SAMP8海马中较SAMR1（快速老化小鼠的另一亚系）海马明显降低，而bcl2a,PS2和tau mRNA水平却有显著意义的增高。这些结果表明在AD病人脑中一些

4、异常基因表达也在SAMP8中存在。在AD病人中发现胰岛素脑脊液/血浆比率降低曾被认为是脑糖代谢紊乱的机制，而通过对SAMP8研究证实，脑血管屏障完整性或对胰岛素转运能力的变化并非SAMP8鼠学习和记忆下降的基础。KumarVB等1研究小组证实，反义磷酸硫解酶低聚核苷酸（AO）能够降低SAMP8脑内自然过表达的APP及逆转其学习及记忆的下降。SAMP8成功培育后，逐渐在众多AD模型中占据重要地位，在国外已被广泛应用于阐明学习记忆功能及学习记忆功能障碍的基本机制,评价干预老化关联的疾病和改善学习记忆机能药物，但国内因SAMP8鼠来源多有不便，相关研究开展较少。单因素损伤致AD动物模型 &

5、#160;  早期主要用化学物质如大田软海绵酸（okadaic acid）、AlCl3、海人藻酸（kainic acid）以及淀粉样蛋白等进行脑室或核团内注射，使之出现AD的病理典型表现（NFTs及SP）和学习功能障碍，大致可分为两类：    1.与tau蛋白过度磷酸化有关的损伤模型 Okadaic acid (OA)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶(1A和2A)的特异性抑制剂。Nelson等2将OA注入成龄绵羊大脑，3月后在注射部位及其周围呈现神经细胞内神经纤维丝缠结（NFT），OA大鼠侧脑室注射6周后免疫组化分析可见NFT样磷酸化Tau蛋白

6、和A淀粉样沉积斑块，而长期脑室投递可引起动物的记忆严重缺失。OA诱导的神经退行性变性和tao 蛋白的磷酸化及氧化损伤有关。通过注入海人藻酸损毁nbM获得出现几乎所有的AD样行为学及病理学变化，典型的老年斑（SP）广泛见于皮层区域，tao蛋白样神经元在扣带回，海马CA2区及下托和顶叶远高于正常组。但似乎并未见有神经细胞内神经纤维丝缠结的证据。而MurayamaH等3认为聚集的AL和PDH tau蛋白磷酸化表面抗原决定簇结合并屏蔽，且能直接和PHF tao 蛋白结合，即在AD脑的神经纤维退行性变性中，出现AL与PFH tau 蛋白直接和磷酸化依赖地交互作用。利用小鼠脑室内注射AlCl3、长期腹腔内

7、连续注射或口服铝溶液获得出现AD病人NFT病理改变的动物模型，成为研究铝与AD关系有效工具之一。而在铝矿区内长期高铝暴露是老年人群认知能力下降不利因素4，利用慢性铝中毒制作AD模型，可用于研究环境高铝暴露与AD关系。    2.与A沉积相关动物模型 淀粉样蛋白（AP）是AD病人老年斑的核心部分，利用AP选择性损毁与AD的病变密切相关的胆碱能神经元集中部位如海马、前脑Meynert基底核等，制作的AD模型一度成为研究AD 的主要工具。 Giovannelli等5报道于脑内注射AP制作AD模型，给大鼠脑基底核注射A140和A2535淀粉样多肽，可观察到注射部

8、位有刚果红染色物质聚集，CHAT活性降低及基底核胆碱能神经元减少，海马胶质细胞反应性增生，皮质和海马神经元数量较对照组明显减少，神经元退化，刚果红染色血管呈阳性，银染提示有神经纤维丝状物。采用同样方法在海马内注射A2535，发现海马NOS阳性神经元减少，并出现NOS阳性星形胶质细胞，大鼠出现学习记忆能力下降6。隔核内注射AP未见有类似病理变化，且大鼠的分辨学习能力没有明显改变，Urani等7采用脑室内连续14 d单纯注射A140，避免脑组织的急性损伤，未能获得NFT等AD特征性的病理改变。尽管这些研究结果不一致，可能与使用的剂量和注射的部位有关，但脑内注入A损毁胆碱能神经元集中的部位，诱导建立

9、AD动物模型，仍不失为一类较为接近AD病人病理实际变化动物模型。    单因素损伤模型只能模拟较少部分AD病理变化的局限性，使得其在AD应用中逐渐被日益成熟的多因素损伤模型和蓬勃发展的转基因动物模型替代。多因素损伤复合动物模型    1.双因素联用诱导的AD模型  A与D半乳糖（Dgal）联合诱导的AD模型。在腹腔注射Dgal的基础上,海马内注射A可导致大鼠的学习记忆减退, 出现A沉积、神经元死亡、胶质细胞浸润等8，同时可导致神经元丢失以及海马CAl区线粒体结构损伤。该模型集衰老、A沉积和记忆功能损害等AD主要病理学改变，国

10、内应用较为广泛。氯化铝与Dgal联合诱导的AD模型。采用腹腔注射 D半乳糖和AlCl3灌胃合并制备AD模型,模型组小鼠出现了胆碱能神经元及其他神经元不同程度的丢失,学习记忆能力减退,脑组织出现A沉积并有类SP和NFT形成,较成功地模拟了AD的发病及病理特征。造模后发现模型小鼠脑内海马部位APP基因表达水平显著提高，刚果红染色结果显示,海马SP的数量明显增加9。该模型集铝中毒、衰老、A沉积、NFT形成和记忆功能损害于一身，造模方法简单,造价低廉,适合大规模药物筛选。Wortmannin和GF109203X联用损害模型。王建枝10同时在大鼠侧脑室或双侧海马注射wortmannin(磷脂酰肌醇3激酶

11、抑制剂)和GF109203X(蛋白激酶C抑制剂),大鼠出现明显行为学障碍,海马GSK3酶活性增加到原来的3.7倍， Tau蛋白一些特殊位点磷酸化明显增强,并出现NFT样病理变化，而骨架蛋白Tau的特殊位点的磷酸化程度与动物的学习、记忆障碍正相关,即Tau蛋白过度磷酸化程度越高,大鼠学习记忆能力越差。该类模型可用于筛选针对蛋白激酶过度激活引发的Tau蛋白AD样异常过度磷酸化、NFT样病理变化及学习、记忆障碍的AD治疗药物,还可用于研究蛋白激酶和AD发病机制之间的内在关系。其他双因素联用损伤AD模型。主要采用Dgal致衰老结合胆碱能神经系统损伤或A诱导等其他因素制作AD模型，如喹啉酸(QA)与Dg

12、al联合诱导的AD模型，利用兴奋性氨基酸受体激动剂QA海马内注射破坏海马胆碱能神经元，也有用具有神经毒作用的鹅膏蕈(ibotenic acid,IBO) 脑内注射结合大鼠腹腔注射Dgal方式或将A40和小剂量的IBO共同注入大鼠海马制作AD模型，这些模型均能较好的模拟出类似AD的部分病理变化，是国内研究AD常用模型。双因素联用损伤AD模型在临床上不仅有记忆功能的损害，同时兼见衰老表现，较好的模拟了AD的主要病理学改变，而动物自愈倾向和自愈时限的研究未见报告, 建立稳定性、重复性更好的模型有待进一步深入研究。    2.三因素联用损伤致AD模型  东莨菪碱

13、(SCOP)、AlCl3与Dgal联合诱导的AD模型。研究者在每日Dgal腹腔注射和胃饲AlCl3水溶液连续4周的基础上于实验观察前腹腔注射SCOP诱导AD模型，拟建立集衰老、铝中毒以及胆碱能系统损害为一体的三因素AD动物模型。该模型学习记忆能力显著下降,且其记忆损害程度依次为:SCOP+AlCl3+Dgal组Dgal+胃饲AlCl3组Dgal+注射SCOP组。IBO、Dgal联合与A140诱导的AD模型。大鼠皮下注射Dgal 56 d的基础上于Meynert基底核一次性注射IBO和左侧脑室连续7 d注射A140诱导AD模型，模型鼠出现记忆障碍,海马皮层锥体细胞数量明显减少,但未见NFT和SP

14、等病理改变,推测可能与脑室作用时间及剂量有关。也有学者在大鼠腹腔内连续注射Dgal 6周后再于双侧海马内分别注射A和IBO诱导AD模型, 三种药物联用采用不同注射方式，均较成功模拟了集衰老、A沉积以及胆碱能系统损害为一体的类似AD病理变化，较双因素损伤模型更能体现疾病的复杂性和病变的广泛性，但也存在注射部位不规范、注射剂量不一致等不统一之处，有待大样本模型验证研究。A140、AlCl3与重组人类转化生长因子1(TGF1)联合诱导的AD模型  在较早期Frautschy等11设计A140 加TGF1双因素两位点注射的大鼠模型,在一个位点,即脑室内注射溶解的A(140),远离前一位点的另

15、一位点注射可促进沉积的不同药物, 避免注射位点附近大量A聚集和复杂的注射损伤的影响。研究证实TGF1和A140注射后可出现大量弥散性A沉积。国内学者于大鼠侧脑室内连续14 d注入A140。连续5 d注入1%氯化铝溶液，首次注射时在丘脑前背侧核注入IOngTGF1，模型鼠不但出现大量淀粉样蛋白沉积、ChAT活性降低，且在3个月后出现AD特征性的SP和NFT，此模型的这些特点都弥补了单因素铝中毒模型的不足。三因素损伤模型近年开展日渐增多，笔者认为过多的损伤因素不仅加重动物的病理负担，而且加大制作模型的难度，模型动物存活率低，模型的稳定性和可重复性必定受到不同程度影响，因此结合实验研究目的适当选择双

16、因素损伤模型更为合理，如研究环境铝暴露与AD关系可选用大鼠长期口服铝液结合A海马注射制作AD模型，不仅缩短造模时间，避免单一铝中毒造模时间过长，又能更为接近环境高铝暴露下实际状况。结合铝与tau蛋白磷酸化密切关系及A毒性制作的双因素损伤AD模型更具有现实意义。在国内大多数实验室不具备开展转基因动物模型条件下，多因素损伤模型将是研究AD的主要选择。转基因动物模型    1.转APP基因鼠  最早于1991年首次报道成功将淀粉样蛋白前体(beta amyloid precursor proteins, APP)基因转入小鼠后，AD转基因动物模型成为AD研究热

17、点。PDAPP小鼠。Games等第1次报道转人类APP695swe和APP717VF突变的PDAPP鼠，它是由C57BL/6鼠与DBA/2F1鼠交配产生。研究发现转入人类突变的APP基因小鼠有APP高水平的表达，并于69月时在海马、胼胝体及大脑皮层出现细胞外大量的AP沉积、神经炎斑块、突触丧失和小胶质细胞增生等类似AD的病理特征，但未见形成NFT。转入人突变型APP基因并表现A沉积的小鼠转基因模型,标志着AD转基因动物模型研究进入了新阶段。而Dave M12用AP疫苗免疫转基因鼠能够显著的减少淀粉样沉淀及减轻记忆力下降，支持AP作为AD中心角色的假说，转PDAPP基因鼠为研究AD带来新的突破，

18、使得AD研究得到前所未有的高度。Tg2576小鼠。Hsiao等13申请了专利的转基因鼠。Tg2576小鼠是转人类APP695基因小鼠,存在2个位点突变:670位赖氨酸突变成天门冬酰胺和671位蛋氨酸突变成亮氨酸。该小鼠在912个月时出现SP，随着A量的增多,A沉积逐渐出现在额叶、颞叶、内嗅皮质、海马、海马回钩前部、海马回和小脑，其行为学改变有学习和记忆损伤等。Tg2576小鼠成功研制使其成为研究AD的提速工具，得到广泛应用。APP23小鼠。将人类APP695基因通过仓鼠由转人类APP695鼠和APP V717I鼠交配得来的APP23小鼠，比正常小鼠脑内多7倍的APP。在6个月时已有A沉积，到24个月时大量出现在皮质和海马,同时出现炎性反应:神经炎、突触损伤及tau过度磷酸化，A沉积随着年龄增长出现数量和体积增多。大脑淀粉样血管病更加区域化，在脑脊液中出现更多可溶性A,SP比AD脑中的斑点可溶性更高。空间记忆障碍开始出现在