马齿苋甜菜红素抗肿瘤实验研究

1、马齿苋甜菜红素抗肿瘤实验研究         【摘要】目的观察马齿苋甜菜红素联合环磷酰胺(CTX)的抗肿瘤作用。方法将接种S180瘤细胞的小鼠分为荷瘤对照组、CTX组、马齿苋甜菜红素(高、中、低剂量)+CTX组。给药10 d，进行抑瘤率 计算 ，以及外周血常规、骨髓有核细胞计数、脾脏、胸腺指数、免疫球蛋白、肝肾功能等的检测。结果与荷瘤对照组相比，CTX组肿瘤生长明显受到抑制。马齿苋甜菜红素低、中、高剂量联合CTX各组抑瘤率明显高于CTX组的抑瘤率。与荷瘤对照组相比，单一CTX处理组脾脏和胸腺指数、IgA、IgG、I

2、gM水平明显降低，WBC、PLT和骨髓有核细胞计数降低，ALT、BUN升高。不同剂量的马齿苋甜菜红素联合CTX处理，可以不同程度地改善脾脏和胸腺指数、IgG、IgM等免疫水平指标，提高WBC、PLT和骨髓有核细胞的数量，降低ALT和BUN。结论马齿苋甜菜红素对小鼠S180肉瘤有抑制作用，对化疗药物CTX抗S180小鼠具有增效减毒的作用。 【关键词】   马齿苋甜菜红素抗肿瘤环磷酰胺S180小鼠Abstract：ObjectiveTo explore the role of betacyanins extracted from Portulaca oleracea L. in the

3、therapeutic effect of cyclophosphamide (CTX) and its side-effect in mice loaded with S180 murine sarcoma cells.MethodsThe mice inoculated with S180 murine sarcoma cells were divided into 5 groups: S180 control group, sc 2 mg/kg·d of CTX group,  ig betacyanins (250，500 and1000 mg/ kg·d

4、 ) + sc CTX groups. After 10-day treatment, the tumor inhibition rate, peripheral blood cells, bone marrow karyocytes, immunoglobulin (Ig), the index of spleen and thymus, the liver and renal function were evaluated respectively. ResultsAlthough CTX application separately led to decrease of the inde

5、xes of spleen and thymus and the levels of IgG and IgM, the CTX application combined with different doses of betacyanin not only increased the tumor inhibition rate, but also improved the indexes of spleen and thymus and the levels of IgG and IgM. Similarly, the CTX in combination with different dos

6、es of betacyanin had a larger number of white blood cell (WBC), platelet (PLT) and bone marrow karyocytes than CTX group. Furthermore, betacyanin application also alleviated the CTX-induced increase of alanine aminotransferase (ALT) and blood urea nitrogen (BUN) in S180 mice. ConclusionBetacyanins e

7、xtracted from Portulaca oleracea L. can enhance therapeutic effect of CTX and reduce its side-effect in the S180 mice.Key words：Portulaca oleracea L.;   Betacyanins;   Anti-tumor;   Cyclophosphamide;   S180 mice马齿苋Portulaca oleracea L.为马齿苋科一年生肉质草本植物，广布于温带和热带地区

8、，在许多国家作为药食两用植物使用。多以其干燥地上部分入药，性味酸寒，具有清热解毒，凉血止血之功。主治热痢脓血、热淋、带下、痛肿恶毒、丹毒1。近年来的药理研究表明，马齿苋具有杀菌、降血脂、降血糖、抗动脉粥样硬化等功能2，其抗癌作用也有报道35。马齿苋化学成分复杂，主要含有生物碱、萜类、有机酸、香豆素、黄酮、挥发油和多糖等6。但是对于马齿苋中含有的特有色素甜菜红素及其功效却鲜有报道。甜菜素是一种水溶性含氮色素，因最早发现于甜菜根中而得名，是吡啶衍生物，包括甜菜红素和甜菜黄素两种形式。到目前为止，人们发现甜菜素只能在石竹目部分科的植物中合成7。近年来国外对甜菜素的研究日益活跃，其价值也突破了作为食品

9、添加剂的局限性，其抗氧化及疗效正引起了人们的关注812。为了进一步了解马齿苋的药效物质基础，我们从马齿苋中分离提纯了甜菜红素，并对其可能存在的抗癌作用进行了研究分析，以期为进一步明确马齿苋中的有效成分，增加对其有效成分分离提纯、深加工和开发应用的针对性以及马齿苋中药饮片的炮制和制剂工艺提供理论依据。 1  材料    昆明种小鼠，雌雄各半，体重为1822 g，由山东大学药学院提供。小鼠S180肉瘤腹水型细胞由 中国 科学 院上海药物研究所提供。环磷酞胺(CTX)为济南制药厂生产。 2  方法 2.1  马齿苋甜菜红素的分离提纯参照王长泉等13的

10、方法，取马齿苋的红色茎段，剪碎后于液氮下研磨，分别以10倍体积的甲醇浸提30 min，4 下 以8 000 g离心10 min，弃去上清液，连续3次，沉淀用双蒸水浸提30 min，12 000 g于4 离心10 min后取上清液合并，即为马齿苋甜菜红素水溶液。然后按照孙世萍等14的方法，用高效液相色谱仪分离提纯。高效液相色谱仪系统(岛津公司)：配LC-10ADvp泵、二级管阵列检测器SPD-M10Avp，柱温箱CTO-10Avp，CLASS-VP 站。色谱柱：Shim-pack vp-ODS (150 mm×4.6 mm i.d., 5 m),预柱：him-pack Gvp-ODS

11、(10 mm×4.6 mm i.d, 5m)，流动相： A：甲醇、B：2% 冰醋酸缓冲液(AB =2080 V/V) ，流速0.7 ml/min，检测波长：535 nm，柱温：室温，收集洗脱时间为46 min段的洗脱液。再用真空旋转蒸发仪（R201 型旋转蒸发仪，上海申科仪器厂）于 40浓缩，直到水完全蒸发，得到紫红色粉末即为马齿苋甜菜红素，-70 保存备用。2.2  动物分组与给药无菌条件下抽取67 d 生长良好的S180小鼠的腹水，按13用生理盐水稀释，充分混匀，在显微镜下瘤细胞计数，用生理盐水调整细胞数为1.0×105/ml，取0.2 ml于每只小鼠右侧腋窝

12、下碘酊消毒后皮下接种，制备S180荷瘤小鼠模型。小鼠接种采用随机法分成荷瘤对照组、CTX组、马齿苋甜菜红素低、中、高剂量+CTX组等5组。荷瘤对照组用生理盐水灌胃，0. 4 ml/只，1次/d，连续10 d。单纯化疗组腹腔注射CTX 2 mg·kg-1·d-1，同时用生理盐水灌胃，0. 4 ml/只，1次/d，连续10 d。马齿苋甜菜红素低、中、高剂量+CTX组的化疗药物剂量、给药途径及时间与CTX组相同，同时低、中、高剂量组为分别给予250，500，1 000 mg· kg-1·d -1的马齿苋甜菜红素灌胃，0.4 ml/只，1次/d，连续10 d。2

13、.3  计算抑瘤率和脾脏、胸腺指数 于最后一次给药后24 h处死小鼠，称鼠体重，剥离肿瘤称瘤重。按下式计算抑瘤率。   抑瘤率（%）=(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。   以无菌操作取下脾脏、胸腺， 电子 天平称量并下式计算脾脏(胸腺)指数。   脾脏(胸腺)指数=脾脏(胸腺)重/体质量×10002.4  外周血常规、免疫球蛋白和肝肾功能的检测雅培C8000型全自动生化分析仪检测免疫球蛋白和肝肾功能，血细胞自动分析仪检测血常规。2.5  骨髓有核

14、细胞计数按照冯雪梅等15的方法，剥离股骨取小鼠完整右侧股骨用7号针在股骨膝关节端打一小孔，抽取3%冰醋酸溶液反复冲洗其骨髓细胞于10 ml 3%冰醋酸溶液内，4号针头过滤后，充分混匀，在血细胞计数盘上计数4个大方格的细胞数，然后乘以2.5×104，得1根股骨中的骨髓有核细胞总数。         3   结果 3.1  马齿苋甜菜红素对化疗小鼠体重和瘤重的影响3.2  马齿苋甜菜红素对化疗小鼠免疫器官质量和血清免疫球蛋白的影响 3.3  马齿苋甜

15、菜红素对化疗小鼠外周血象和骨髓有核细胞计数的影响3.4  马齿苋甜菜红素对化疗小鼠肝肾功能的影响 4  讨论 甜菜素作为重要的植物次生代谢物质在离体条件下具有很强的抗氧化和清除氧自由基的能力，可以用来 治疗 与过氧化胁迫有关的人体机能失调7。体外实验表明，甜菜根提取液对小鼠的皮肤癌和肺癌细胞具有显着的抑制作用8，9。Allegra等10发现甜菜素可以通过与人类髓过氧化物酶及其中间体作用而清除次氯酸。Tesoriere等11发现食用含有甜菜素的刺梨果实后，可以明显降低过氧化胁迫造成的脂质损害，提高人体的抗氧化水平。而且人体红血球的抗氧化能力明显增加，离体红血球在甜菜

16、素溶液中培养一段时间也可以明显延迟由于氧化剂异丙基苯过造成的溶血作用12。国内对马齿苋的抗癌作用也有研究，但都没有明确有效成分35。本研究通过马齿苋甜菜红素联合CTX抗S180荷瘤鼠发现，联合组肿瘤抑制率高于CTX组，说明马齿苋甜菜红素具有潜在的抗癌功能，对CTX化疗效果一定增强作用。胸腺、脾脏质量在一定程度上反映了机体免疫功能的强弱，而IgG、IgM的水平反映了体液免疫能力。本研究显示，荷瘤小鼠应用CTX后脾脏和胸腺指数、IgG和IgM的水平均下降，通过联合马齿苋甜菜红素可使脾脏和胸腺指数增加、促进IgG、IgM的分泌，说明马齿苋甜菜红素可缓解化疗药物CTX所致的免疫抑制。而且，马齿苋甜菜红

17、素联合CTX应用，还可以不同程度地抑制单独使用CTX后引起的ALT、BUN升高，WBC、PLT和骨髓有核细胞计数明显降低，说明CTX所引起的肝功能损害与骨髓抑制状态得到改善。总之，马齿苋甜菜红素与化疗药物CTX合用可增强CTX抑制肿瘤生长的作用，同时减轻其所致的骨髓抑制、免疫功能和肝功能的损害，具有增效减毒作用。【 参考 文献 】 1 中国 科学 院药物研究所. 中药志M. 北京: 人民卫生出版社, 1988: 18.2杜士明, 蔡华, 梁俊, 等. 马齿苋药理研究进展及开发思路J. 中国药房. 2007, 18(27): 2145.3朴龙,张学武. 马齿苋正丁醇提取物体内抑瘤作用及其机理研究

18、J. 四川中医, 2007, 25(12): 19.4崔丽敏, 张学武. 马齿苋提取物抑制肺癌A549细胞增殖的实验研究J. 四川中医, 2007, 25(12): 15.5崔香淑, 金元哲, 张学武. 马齿苋提取物对肝癌细胞HepG-2抑制作用的实验研究J. 时珍国医国药, 2007, 18(5): 1065.6姚佳琪, 孟 娜, 宋少江, 等. 马齿苋的化学成分J. 沈阳药科大学学报, 2007, 24(12): 751.7王长泉, 刘涛, 王宝山. 植物甜菜素研究进展J. 植物学通报, 2006, 3: 302.8Kapadia GJ, Tokuda H, Konoshima T, et al. Chemoprevention of lung and skin cancer by Beta vulgaris (beet) root extractJ. Cancer Lett., 1996, 100: 211. 9Kapadia GJ, Azuine MA, Sridhar R, et al. Chemoprevention of DMBA-induced UV-B promoted,