脱氢表雄酮对实验性自身免疫性神经炎大鼠细胞免疫的影响

1、脱氢表雄酮对实验性自身免疫性神经炎大鼠细胞免疫的影响        【摘要】  目的: 探讨脱氢表雄酮（DHEA）对实验性自身免疫性神经炎（EAN）大鼠细胞免疫反应的影响。方法:21只Lewis大鼠随机分为DHEA 0.5 mg组、 2 mg治疗组和对照组, 治疗组于注射牛周围神经髓磷脂（BPM）抗原乳剂后第5天开始每日皮下注射DHEA, 对照组皮下注射相同体积的DHEA溶媒。疾病高峰期检查坐骨神经IFN、 TNF阳性反应细胞, 检测引流淋巴结和脾脏单个核细胞增殖反应, 检测培养上清TNF、 IFN、 I

2、L10含量。结果: 两种剂量DHEA治疗组均能减少坐骨神经IFN、 TNF阳性反应细胞数目(P<0.05), 抑制BPM刺激T淋巴细胞增殖(P<0.05), 降低培养上清中IFN、 TNF水平(P<0.05)。各组间 IL10水平差异无统计学意义（P>0.05）。结论: DHEA可抑制EAN大鼠自身反应性T淋巴细胞增殖和促炎性细胞因子过度表达, 抑制细胞免疫反应。 【关键词】  脱氢表雄酮 神经炎 实验性自身免疫性 细胞免疫脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone, DHEA）是3种肾上腺皮质类固醇之一, 是雌激素和雄激素的前体物质, 也是目前

3、尚不明确的多种免疫调节性类固醇的前体物质。体内、 外研究证实DHEA及其代谢产物具有抗炎、 抗增殖和免疫调节活性, 对人和动物的免疫系统可产生有益的作用1。DHEA能改善病毒、 细菌或其他感染实验动物的存活率2; 尘螨诱导的变应性气道疾病小鼠服用DHEA, 可降低支气管灌洗液中嗜酸细胞数目, 降低IL4、 IL5、 IFN和IgE水平3; 超生理浓度的DHEA可抑制T细胞受体介导的体外T淋巴细胞增殖, 使KLH致敏脾脏细胞IL4生成增加、 IFN水平下降4; 系统性红斑狼疮患者服用DHEA治疗, 表现出明显的病情改善, 对糖皮质激素治疗需求量减少5。上述研究提示DHEA影响细胞和体液免疫应答。

4、实验性自身免疫性神经炎（experimental autoimmune neuritis, EAN）是CD4+ T细胞介导的外周神经自身免疫性脱髓鞘疾病, 是公认的研究格林巴利综合征（GBS）的经典动物模型, 目前国内外尚未见有DHEA影响EAN免疫反应的报道。基于以往体内外研究证实的DHEA对免疫系统的作用, 我们应用DHEA干预发病初期EAN大鼠, 观察对细胞免疫反应的影响, 以探讨治疗GBS的新方法。1  材料和方法1.1  材料  DHEA、 二甲基亚砜、 弗氏不完全佐剂均购自SigmaAldrich公司; H37Ra株热灭活结核杆菌、 植物血凝素（PHA

5、）购自Difco公司; 免疫组化用一抗购自RD公司, 二抗购自Invitrogen公司; Ficocl淋巴细胞分离液、 RPMI1640培养液、 胎牛血清均购自Gibco公司; 3H甲基胸腺嘧啶核苷购自原子能研究所; 酶联免疫分析试剂盒购自Bender MedSystem, Inc公司。超速离心法自牛脊神经根提取周围神经髓磷脂（bovine peripheral myelin,  BPM）; Lewis大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。1.2  方法2  结果2.1  DHEA减少外周神经促炎细胞因子产生  应用免疫组化技术检测EAN高

6、峰期大鼠坐骨神经中IFN、 TNF表达, 结果显示 DHEA 2 mg治疗组和0.5 mg治疗组IFN、 TNF阳性反应细胞数均较对照组明显减少(P<0.05 ), DHEA 2 mg 治疗组与0.5 mg治疗组比较IFN、 TNF阳性反应细胞数未见明显差异（表1, 图1、 2）。表1  坐骨神经细胞因子阳性细胞数（个/mm2组织）（略）Tab 1  Numbers of cytokineexpressing cells per mm2 sciatic nerve sectionsaP<0.05  vs control group.图1  坐

7、骨神经IFN表达（略）Fig 1  IFNexpressing cells in sciatic nerve sectionsA: Control group; B: DHEA 0.5 mg/day; C: DHEA 2 mg/day.图2  坐骨神经TNF表达（略）Fig  2  TNFexpressing cells in sciatic  nerve sectionsA: Control group; B: DHEA 0.5 mg/day; C: DHEA 2 mg/day.2.2  DHEA抑制淋巴细胞增殖反应  于

8、EAN高峰期检测大鼠引流淋巴结和脾脏单个核细胞增殖。与对照组比较, DHEA 2 mg治疗组和0.5 mg治疗组均能明显抑制BPM和PHA诱导的单个核细胞增殖(P<0.05 ); PBS(无抗原刺激)组单个核细胞培养显示DHEA 2 mg治疗组对单个核细胞增殖有明显抑制作用(P<0.05), 0.5 mg治疗组与对照组比较无统计学意义（表2）。表2  淋巴细胞体外增殖反应（略）Tab 2  T cell proliferation in vitro (cpm)aP<0.05  vs control group.2.3  DHEA影响单个

9、核细胞培养上清中细胞因子水平  应用ELISA检测引流淋巴结和脾脏单个核细胞培养上清中IFN、 TNF、 IL10水平。结果显示, 与对照组比较, DHEA 2 mg治疗组和0.5 mg治疗组均能减少IFN和TNF生成(P<0.05), DHEA 2 mg治疗组IFN和TNF水平较0.5 mg 治疗组降低(P<0.05); 各组间 IL10水平未显示明显的差异（表3）。表3  BPM刺激单个核细胞培养上清细胞因子水平比较（略）Tab 3  Levels of cytokine production by BPMrestimulated  sp

10、leen cell supernatantsaP<0.05vs control group.3  讨论    DHEA是人体内含量最丰富的类固醇, 已有许多研究证实DHEA或其代谢产物可调节Th1/Th2细胞免疫失衡, 可能对自身免疫性疾病有治疗作用6, 7。EAN是由外周神经髓磷脂或其蛋白质成分主动免疫或通过过继转移外周神经抗原特异性T细胞在易感啮齿类动物诱导的, 是CD4+ T细胞介导的外周神经自身免疫性脱髓鞘疾病。我们应用DHEA干预发病初期EAN（免疫后炎症阶段）, 结果显示, DHEA 0.5 mg/剂和2 mg/剂两种剂量均能抑制BPM

11、诱导的单个核细胞增殖, 减少病灶局部及BPM刺激后单个核细胞培养上清IFN、 TNF产生, 提示DHEA可抑制细胞免疫反应, 抑制Th1细胞功能。Du等6应用DHEA治疗SJL/J 小鼠过继转移性EAE, 可阻止病情进展, 降低脊髓促炎性细胞因子IFN、 IL12p40、 TNF、 iNOSmRNA表达。Offner等8应用人工合成的DHEA衍生物HE2200和DHEA代谢产物HE2500预防性治疗SJL小鼠EAE, 两者均可减轻疾病严重程度, 降低血浆中PLP特异性抗体水平, 抑制PLP诱导的淋巴细胞增殖, 降低脊髓中TNF、 TNF、 IFN、 MIP1、 MCP1 mRNA表达。上述研究

12、与我们的结论一致。    外周神经内膜下T淋巴细胞、 巨噬细胞浸润及多灶性、 节段性髓鞘脱失是EAN的主要病理改变, 促炎细胞因子（IFN、 TNF、 IL12、 NO等）在发病机制中起重要作用。外周神经内膜下浸润的T淋巴细胞释放IFN激活巨噬细胞, 后者通过吞噬作用和释放炎性细胞因子（如TNF）, 直接损伤神经髓鞘。有证据表明, IFN在血清、 外周淋巴组织和周围神经中的水平与EAN临床症状相平行, IFN缺失小鼠抵抗EAN的发生9。TNF被认为在免疫介导的髓鞘脱失中起直接作用,  向大鼠坐骨神经中注射TNF, 导致神经内膜血管壁淋巴细胞聚积, 髓鞘脱

13、失, 轴索变性10。提示IFN和TNF在EAN发病中的关键作用。本研究显示, DHEA可降低全身和病灶局部IFN、 TNF水平, 对IL10产生无影响。推测DHEA对EAN的治疗作用主要是下调Th1反应, 抑制促炎性细胞因子过度分泌, 对Th2细胞因子水平无影响。    我们的实验结果显示, 与0.5 mg/剂治疗组比较, 2 mg/剂治疗组能明显减少单个核细胞培养上清IFN、 TNF产生, 提示DHEA对免疫功能的影响存在剂量相关性。    细胞因子生成过多是以Th1/Th2为基础的免疫失调的中心环节, 如何纠正机体的免疫失调, 是

14、目前治疗自身免疫性疾病所面临的关键问题。虽然DHEA及其代谢产物在调节Th1/Th2细胞功能中的确切作用尚存在争议11, 但是上述实验结果表明, 该类分子是促炎性细胞因子过度表达的抑制剂, 可能对T淋巴细胞、 巨噬细胞等多种免疫细胞产生作用, 有希望成为治疗自身免疫性疾病的一种新手段。 【】  1 von Mühlen D, Laughlin GA, KritzSilverstein D, et al. The Dehydroepiandrosterone And WellNess (DAWN) study: research design and methods

15、J. Contemp Clin Trials, 2007, 28(2): 153-168.2 Oberbeck R, Dahlweid M, Koch R, et al. Dehydroepiandrosterone decreases mortality rate and improves cellular immune function during polymicrobial sepsisJ. Crit Care Med, 2001, 29(2): 380-384. 3 Yu CK, Yang BC, Lei HY, et al. Attenuation of house dust mi

16、te Dermatophagoides farinaeinduced airway allergic responses in mice by dehydroepiandrosterone is correlated with downregulation of TH2 responseJ. Clin Exp Allergy, 1999, 29(3): 414-422.4 Du C, Guan Q, Khalil MW, et al. Stimulation of Th2 response by high doses of dehydroepiandrosterone in KLHprimed

17、 splenocytesJ. Exp Biol Med (Maywood), 2001, 226(11): 1051-1060.5 van Vollenhoven RF. Dehydroepiandrosterone for the treatment of systemic lupus erythematosusJ. Expert Opin Pharmacother, 2002, 3(1): 23-31.6 Du C, Khalil MW, Sriram S. Administration of dehydroepiandrosterone suppresses experimental a

18、llergic encephalomyelitis in SJL/J miceJ. J Immunol, 2001, 167(12): 7094-7101.7 Duan RS, Link H, Xiao BG. Dehydroepiandrosterone therapy ameliorates experimental autoimmune myasthenia gravis in Lewis ratsJ. J Clin Immunol, 2003, 23(2): 100-106.8 Offner H, Zamora A , Drought H , et al. A synthetic an

19、drostene derivative and a natural androstene metabolite inhibit relapsingremitting EAEJ. J Neuroimmunol, 2002, 130(1-2): 128-139.9 Zhu Y, Ljunggren HG, Mix E, et al. Suppression of autoimmune neuritis in IFNgamma receptordeficient miceJ. Exp Neurol, 2001, 169(2): 472-478.10 Weishaupt A, Brück W

20、, Hartung T, et al. Schwann cell apoptosis in experimental autoimmune neuritis of the Lewis rat and the functional role of tumor necrosis factoralphaJ. Neurosci Lett, 2001, 306(1-2): 77-80.11 Dillon JS. Dehydroepiandrosterone, dehydroepiandrosterone sulfate and related steroids: their role in inflam

21、matory, allergic and immunological disordersJ. Curr Drug Targets Inflamm Allergy, 2005, 4(3): 377-385.1         表2  淋巴细胞体外增殖反应（略）Tab 2  T cell proliferation in vitro (cpm)aP<0.05  vs control group.2.3  DHEA影响单个核细胞培养上清中细胞因子水平  应用ELIS

22、A检测引流淋巴结和脾脏单个核细胞培养上清中IFN、 TNF、 IL10水平。结果显示, 与对照组比较, DHEA 2 mg组和0.5 mg治疗组均能减少IFN和TNF生成(P<0.05), DHEA 2 mg治疗组IFN和TNF水平较0.5 mg 治疗组降低(P<0.05); 各组间 IL10水平未显示明显的差异（表3）。表3  BPM刺激单个核细胞培养上清细胞因子水平比较（略）Tab 3  Levels of cytokine production by BPMrestimulated  spleen cell supernatantsaP<0

23、.05vs control group.3  讨论    DHEA是人体内含量最丰富的类固醇, 已有许多研究证实DHEA或其代谢产物可调节Th1/Th2细胞免疫失衡, 可能对自身免疫性疾病有治疗作用6, 7。EAN是由外周神经髓磷脂或其蛋白质成分主动免疫或通过过继转移外周神经抗原特异性T细胞在易感啮齿类动物诱导的, 是CD4+ T细胞介导的外周神经自身免疫性脱髓鞘疾病。我们应用DHEA干预发病初期EAN（免疫后炎症阶段）, 结果显示, DHEA 0.5 mg/剂和2 mg/剂两种剂量均能抑制BPM诱导的单个核细胞增殖, 减少病灶局部及BPM刺激后单个核细

24、胞培养上清IFN、 TNF产生, 提示DHEA可抑制细胞免疫反应, 抑制Th1细胞功能。Du等6应用DHEA治疗SJL/J 小鼠过继转移性EAE, 可阻止病情进展, 降低脊髓促炎性细胞因子IFN、 IL12p40、 TNF、 iNOSmRNA表达。Offner等8应用人工合成的DHEA衍生物HE2200和DHEA代谢产物HE2500预防性治疗SJL小鼠EAE, 两者均可减轻疾病严重程度, 降低血浆中PLP特异性抗体水平, 抑制PLP诱导的淋巴细胞增殖, 降低脊髓中TNF、 TNF、 IFN、 MIP1、 MCP1 mRNA表达。上述研究与我们的结论一致。    外

25、周神经内膜下T淋巴细胞、 巨噬细胞浸润及多灶性、 节段性髓鞘脱失是EAN的主要病理改变, 促炎细胞因子（IFN、 TNF、 IL12、 NO等）在发病机制中起重要作用。外周神经内膜下浸润的T淋巴细胞释放IFN激活巨噬细胞, 后者通过吞噬作用和释放炎性细胞因子（如TNF）, 直接损伤神经髓鞘。有证据表明, IFN在血清、 外周淋巴组织和周围神经中的水平与EAN临床症状相平行, IFN缺失小鼠抵抗EAN的发生9。TNF被认为在免疫介导的髓鞘脱失中起直接作用,  向大鼠坐骨神经中注射TNF, 导致神经内膜血管壁淋巴细胞聚积, 髓鞘脱失, 轴索变性10。提示IFN和TNF在EAN发病中的关键

26、作用。本研究显示, DHEA可降低全身和病灶局部IFN、 TNF水平, 对IL10产生无影响。推测DHEA对EAN的治疗作用主要是下调Th1反应, 抑制促炎性细胞因子过度分泌, 对Th2细胞因子水平无影响。    我们的实验结果显示, 与0.5 mg/剂治疗组比较, 2 mg/剂治疗组能明显减少单个核细胞培养上清IFN、 TNF产生, 提示DHEA对免疫功能的影响存在剂量相关性。    细胞因子生成过多是以Th1/Th2为基础的免疫失调的中心环节, 如何纠正机体的免疫失调, 是目前治疗自身免疫性疾病所面临的关键问题。虽然DHEA及其代

27、谢产物在调节Th1/Th2细胞功能中的确切作用尚存在争议11, 但是上述实验结果表明, 该类分子是促炎性细胞因子过度表达的抑制剂, 可能对T淋巴细胞、 巨噬细胞等多种免疫细胞产生作用, 有希望成为治疗自身免疫性疾病的一种新手段。 【】  1 von Mühlen D, Laughlin GA, KritzSilverstein D, et al. The Dehydroepiandrosterone And WellNess (DAWN) study: research design and methodsJ. Contemp Clin Trials, 2007,

28、 28(2): 153-168.2 Oberbeck R, Dahlweid M, Koch R, et al. Dehydroepiandrosterone decreases mortality rate and improves cellular immune function during polymicrobial sepsisJ. Crit Care Med, 2001, 29(2): 380-384. 3 Yu CK, Yang BC, Lei HY, et al. Attenuation of house dust mite Dermatophagoides farinaeinduced airway allergic responses in mice by dehydroepiandrosterone is correlated with downregulation of TH2 responseJ. Clin Exp Allergy, 1999, 29(3): 414-422.4 Du C, Guan Q, Khalil MW, et al. Sti