遗传学发展的背景资料

1、 背景资料遗传学的历史并不长，但其中的发现确实石破天惊，让我们一起来看看，并重新回顾一下当时的惊喜，快乐和担忧。大约公元前10000年，小麦作物的选择育种开始在地中海地区实行。大约公元前400年，希腊医生希波克拉底认为，品质是以混合的流体形式由父母传给孩子的，是父母双方的特征的结合。大约公元前320年，亚里士多德认为婴儿所有的特征来自其父母。公元1001000年，印度人意识到一定的身体特征和疾病会在家族中遗传。1100160年，欧洲人提出了（不正确的）自然产生的理论，即说生物是有非生命物质产生的，1630年，威廉.哈维认识到当一个卵子和一个精子结合（尽管这还没有被显微镜看到）后，婴儿就产生了。

2、1665年，罗伯特.虎克首先用显微镜识别了软木塞上的细胞。1856年1868年，奥地利修道士格雷戈尔.孟德尔研究豌豆种植，发现显性和隐性基因（他称之为因子）。然而，他的工作没有得到重视。1859年，约翰.米歇尔从白血球细胞中分离出DNA，尽管，当时无人知道那是什么。18701890年，运用新的显微技术，科学家观察到了染色体，看到了细胞分裂。1900年，德.夫里耶斯、冯.切尔马克和科伦斯三人重新揭示了孟德尔的理论，证明孟德尔是正确的。1902年，术语“基因”开始用来描述孟德尔的“因子”。1944年，奥斯瓦尔德.埃弗里和他的同事发现DNA携带着遗传信息。1950年，欧文.查格夫发现DNA内含有等量

3、的四种化学碱基：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶（常简写为A、C、G、T）。1952年，罗莎琳的.富兰克林用X光结晶学研究DNA，发现他的螺旋结构。1953年，沃森和克里克发现了DNA的右手双螺旋分子结构。1956年，克里克和该莫夫找出DNA中的碱基是如何为不同的蛋白质编码的。1966年，马歇尔.你伦伯格和他的同事提出了用三字母组的方式为DNA中的不同氨基酸编码的方法。1972年，保罗.伯格通过结合两股DNA链在一起来改变DNA。1975年，弗雷德.商格和其他科学家发展了读取DNA序列的方法。1977年，genentech公司率先用基因改性的细菌制造蛋白质。1981年，科学家开始发现构成特定疾

4、病的基因，例如癌症。1985年，卡瑞.穆利斯开发了聚合酶链反应来复制大量的DNA。1988年，科学家腌制了第一支利用遗传工程及时改变的实验老鼠。1989年，亚历克.杰弗里斯发展了DNA指纹分析方法，用于犯罪检验。1990年，人类基因组计划开始实施。1993年，利用遗传工程技术改变、涉及以有超长保存期的西红柿开始出售。1996年，多利，第一支从成年哺乳动物克隆出来的动物，诞生于苏格兰的罗斯林研究所。2001年，地衣服人类基因组图完成。2002年，不同的科学家宣称他们正致力于克隆人类。一、 原理1） 基本原理1.DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度的变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度

5、为0.14 mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。2.DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。2） 原理补充2.1 DNA的释放本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破。DNA位于鸡血细胞的细胞核中,正常情况下不会释放出来。为了使DNA从细胞核中释放出来,实验中采用了向鸡血细胞液中加入蒸馏水并且搅拌的方法。蒸馏水对于鸡血细胞来说,是一种低

6、渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞破裂。同时,再加上搅拌的机械作用,就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂),于是释放出DNA,当然也有RNA。但是,释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起。2.2 将DNA与蛋白质分离根据二者的特性,即在浓度较高的氯化钠溶液(物质的量浓度为2 moL/L )中,核蛋白容易解聚,游离出DNA。而DNA在浓度较高的氯化钠溶液中的溶解度很高,Na+与带负电的DNA结合成DNA钠盐。这时DNA在溶液中呈溶解状态。2.3 DNA的析出与获取利用DNA在浓度较低的氯化钠溶液中溶解度小的原理,向含有DNA的浓度较高的氯化钠溶液中加入大量(300 mL

7、 )蒸馏水,稀释氯化钠溶液,使DNA的溶解度下降,而蛋白质的溶解度增高(这就是蛋白质的盐溶现象),从而使二者分离。这时,加上不停地搅拌,溶解度下降的DNA逐渐呈丝状物。再通过过滤,滤去蛋白质,就可以获取DNA的黏稠物了。如果采用离心法则更好,用4 000 r/min 的旋转频率,离心15 min ,除去上清液(含有蛋白质),留下的沉淀物中含DNA。2.4 DNA的再溶解再用较高浓度的氯化钠溶液去溶解DNA黏稠物。2.5 DNA的沉淀和浓缩除去了蛋白质的核酸溶液,必须再进一步沉淀和浓缩。最常用的方法是酒精沉淀法。就是将含有Na+的DNA溶液,加入到相当于其两倍体积的体积分数为95%冷酒精溶液中（

8、实验一般要求采用预冷的95的乙醇，但对比结果显示，常温下的乙醇溶液也可产生明显效果。从理论上分析，预冷的乙醇溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。）,混匀以后可以使DNA沉淀、浓缩,形成含杂质较少的DNA丝状物,悬浮于溶液中。如果出现的丝状物较少,可以将此混合液再放入冰箱中冷却几分。浓缩后的DNA丝状物,可以用缓缓旋转玻璃棒的方法卷起(因为玻璃棒有吸附DNA的作用)。2.6 DNA的鉴定本实验中鉴定DNA的方法为二苯胺法。二苯胺法的原理是:DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成-羟基-酮基戊醛

9、,它再和二苯胺作用而显现蓝色(溶液呈浅蓝色)。鉴定时溶液蓝色的深浅,与溶液中DNA含量的多少有关。二、 不同材料DNA提取与鉴定方法1、 高中课本上的实验1.破碎细胞，释放DNA：向510 mL的鸡血细胞液加入20 mL蒸馏水。用玻璃棒沿一个方向小心快速搅拌5 min搅拌，使血细胞膜和核膜胀破。再用34层纱布过滤，除去一些颗粒较大的杂质。2溶解细胞核内的DNA：在溶液中加入两倍体积的浓度为2 mol/L的NaCl溶液，搅拌1 min。注意应沿一个方向搅拌，使DNA充分溶解。3DNA的析出：这一步骤是实验成败的关键。缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌。同时控制加水量，使NaCl

10、溶液的终浓度为0.10.2 mol/L。加水过程一般分三次进行，当总加水量为300 mL左右时，DNA已基本析出。加水太多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。用34层纱布对DNA稀释液进行过滤，滤去蛋白质，收集DNA的黏稠物。此时注意观察DNA黏稠物的颜色（最佳为白色）。4.DNA的初步纯化：继续用2 mol/L的NaCl溶液20 mL溶解DNA黏稠物，仍旧沿一个方向不停搅拌3 min，使DNA充分溶解。用34层纱布进行过滤，滤去杂质，收集含有DNA的滤液。向滤液中贴壁缓慢加入50 mL预冷的体积分数为95的乙醇，并用玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌(玻璃棒不要直插到烧杯底部)，溶液中会出现

11、DNA丝状物。(因为玻璃棒有吸附DNA的作用。也可以用筷子等表面粗糙的用具来帮助DNA分子缠绕。)。5DNA的鉴定：用0.015 mol/L的NaCl溶液5mL溶解DNA丝状物。加入4mL二苯胺试剂，置于沸水中加热5min，注意观察试管溶液颜色的变化。（要做对照组）2、几种新材料的DNA粗提取与鉴定介绍2.1新鲜菜花(或蒜黄、菠菜)DNA粗提取与鉴定一.材料用具新鲜菜花(或蒜黄、菠菜)。塑料烧杯,量筒,玻璃棒,尼龙纱布,陶瓷研钵,试管,试管架,试管夹,漏斗,酒精灯,石棉网,三角架,火柴,刀片,天平。研磨液,体积分数为95%的酒精溶液,二苯胺试剂,蒸馏水。二.方法步骤(1)DNA的粗提取准备材料

12、 将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室,至少24 h。取材 称取30 g菜花,去梗取花,切碎。研磨 将碎菜花放入研钵中,倒入10 mL研磨液,充分研磨10 min 。过滤 在漏斗中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液滤入烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心,用1 000r/min的旋转频率,离心25 min,取上清液放入烧杯中)。在4S冰箱中放置几分后,再取上清液。加冷酒精 将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95%的冷酒精溶液中,并用玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液(玻璃棒不要直插烧杯底部)。沉淀35 min后,可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转,絮状物会缠在玻

13、璃棒上。(2)DNA的鉴定配制二苯胺试 剂取0.1 mL B液,滴入到10 mL A液中,混匀。鉴定 取4 mL DNA提取液放入试管中,加入4 mL 二苯胺试剂,混匀后观察溶液颜色(不变蓝)。用沸水浴(100 )加热10 min 。在加热过程中,随时注意试管中溶液颜色的变化(逐渐出现浅蓝色)。2.2洋葱DNA粗提取实验与鉴定（值得推介，它取材容易，操作简便，效果明显。）一、实验原理洗涤剂等去污剂可以溶解细胞的细胞壁，破坏细胞膜，同时也能使蛋白质变性。当细胞壁破坏后，细胞释放出核酸与蛋白质形成的复合物核糖核蛋白(RNP)和脱氧核糖核蛋白(DNP)，这两种复合物在不同电解质溶液中的溶解度有较大差

14、异。当NaCl浓度达到0.14molL时，DNP溶解度约为纯水中溶解度的1，但RNP则不一样，在0.14molL NaCl溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相当大，因此在制备DNA时，利用0.14molL稀盐溶液使DNP与RNP分开。 去除蛋白质后的核酸盐溶液，再利用其不溶于有机溶剂的性质，但细胞中的其他物质则可以溶于有机溶剂，应用适当浓度的有机溶剂 (如乙醇)使DNA呈絮状沉淀析出（本实验加入酒精后使食盐浓度接近0.14mol/L）。在溶液中，DNA链略带负电荷，而盐离子可被吸引到DNA的负电荷上，中和这些负电荷，因此就能够使DNA片段聚合在一起，形成絮状粘稠物质。利用这一原理，就

15、可以用酒精萃取DNA。 DNA与二苯胺作用生成蓝色沉淀用来鉴定 DNA。二. 材料：洋葱、洗洁精、食盐、95酒精、蒸馏水、0.015 molL的NaCl溶液：称取0.88g NaCl，投入1000ml容量瓶中，加水到所需体积的刻度线上，溶解后成0.015 molL氯化钠溶液。二苯胺试剂：1 g重结晶的二苯胺溶于100ml冰乙酸（A.R.）中，再加10ml过氯酸，临用前加入1.0ml 16%的乙醛，试剂应为无色，三.器具：匀浆机或研钵、纱布、漏斗、烧杯、玻璃棒、量筒、滴管、试管、天平。四.方法步骤 称取100 g洋葱，切碎，放进搅拌机或研钵中 加入100ml洗洁精充分搅拌或研磨将研磨液用漏斗和两

16、层纱布过滤到烧杯中加入1g食盐，搅拌均匀量取上述澄清的洋葱液50ml加入70ml的95酒精轻轻摇动或用玻璃棒轻轻搅拌白色纤维状粘稠物质析出，即DNA用玻璃棒可将其轻轻卷起，放入1号试管搅拌溶解后，加入4ml二苯胺试剂混合均匀，在沸水浴中加热 38min，观察颜色的变化。五. 实验注意事项1)材料必须充分匀浆或研磨，否则洋葱细胞没有完全破碎，影响实验效果；2)加入酒精后摇动或搅拌时一定要轻缓，否则会破坏DNA，以至于看不到；3)DNA鉴定时，二苯胺最好现配现用，否则二苯胺会变成浅蓝色或绿色，则不能使用。3.几种新材料的DNA粗提取介绍3.1 细菌DNA提取方法（尤其对有荚膜的细菌）方法一1种子加

17、入2ml盛有4预冷的抽提缓冲液（8M LiCl，2% b-巯基乙醇仅针对RNA）离心管中，4过夜； 2离心4s，转移上清到2ml新管中（针对植物）； 3离心，12,000rpm，30min，4（仅针对RNA）； 4弃上清液，用70乙醇洗沉淀，风干； 5溶解上述沉淀于缓冲液（5%SDS，10mMNaCl，25mM EDTA，10mM Tris-HCl，pH7.6，2巯基乙醇）中； 6加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）7离心12,000rpm，10min，转移上清到新管中. 8加入等体积氯仿/异戊醇(24：1) 9离心12,000rpm，10min，转移上清到新管中10分装至两支1.5

18、ml离心管中，各加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），200C沉淀； 11离心12,000rpm，10min； 12. 弃上清，70乙醇洗，也可以再用100乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。方法二1试剂：抽提缓冲液、2% CTAB (W/V)、 2% PVP K25 (w/v) （去色素）、100mM Tris-HCl (pH8.0)、 25mM EDTA (pH8.0)、 2.0M NaClbM.、 2.10M LiClr+1、3. 2M LiCl, DEPC-water（抑制RNA酶活性）、 3M NaAc (pH5.2) 、96% 乙醇、 70% 乙

19、醇2步骤：1）抽提缓冲液65预热；2） 加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65，10min；; 3）加酚、氯仿、异戊醇（25：24：1），振荡，离心12,000rpm，10min；4）取上清，加氯仿、异戊醇（24：1）振荡，离心12,000rpm，10min； 5）取上清，重复4步骤；6）加10M LiCl 1/4体积到上清液；7）4过夜，沉淀DNA；8）离心（12,000rpm，10min），弃上清；9）70乙醇洗，再用100乙醇洗，风干；10） 加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），200C沉淀；11）离心12,000rpm，10min；12

20、）弃上清，70乙醇洗，也可以再用100乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。 3.2 从动物组织提取DNA的方法： 一、材料：哺乳动物新鲜组织。 二、设备： 移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。 三、试剂 1、分离缓冲液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。 2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。 四、操作步骤:1. 切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液

21、,剪碎放入研钵(越细越好)。 2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。 3. 加1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。 4. 加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37保温1-2小时, 直到组织完全解体。 5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm离心数秒钟。 6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm离心 5分钟。7. 取上层水相至干净离心管, 加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。 8. 移去上层乙醚,保留下层水相。 9. 加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀D

22、NA。室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。 10. 用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20保存。 11. 如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5l RNaseA(10g/l), 37保温30分钟, 用酚抽提后, 按步骤9-10重沉淀DNA。3.3 大豆DNA的提取将新鲜大豆叶片保存在冰箱，用时取出。1、称取大豆叶片2克左右，放入研磨钵中，倒入液氮，将其研碎成粉末。2、将粉末装入50ml离心管中；同时将CTAB提取液放入水浴锅中，加温至65度。3、吸取10ml的CTAB提取液

23、和200ul的巯基乙醇放入装有叶片粉末的离心管中。4、充分振荡后，放入65度的水浴锅中，大约40分钟；其间，每隔10分钟轻轻的摇晃离心管，使溶液和粉末充分混合。5、40分钟后，取出冷却至室温，加入等体积的氯仿异戊醇（24：1），充分混匀。6、然后将离心管放入离心机中离心，转速12000rpm，时间大概15分钟，即可。7、取上清液至另一离心管中，再吸取等体积的氯仿异戊醇，混匀离心，重复上述步骤。8、再一次吸取上清液，加入2倍于该上清液体积的冰无水乙醇，轻轻混匀（因为此时DNA已有少许絮状沉淀，避免DNA断裂），放入4度冰箱中，大概1小时左右。9、将DNA沉淀用玻璃器皿将其挑到1.5ml的离心管中

24、，用70%的酒精清洗两遍，放置室温中，待其酒精味挥发完之后（用鼻子闻闻），加入TE溶液即可，这就是DNA原液，放入-20度冰箱保存即可。3.4 植物DNA的SDS（十二烷基硫酸钠）提取法：取2-3g新鲜叶片，在液氮中研磨成粉状（防止溶化）后转入15ml离心管中。加入5ml于65预热的提取缓冲液，65水浴保温30min（摇动数次），使提取液与样品充分混合。加入2ml 5mol/L Kac，剧烈振荡，冰浴保温20 min以上。2700转离心20min，将上清液倒入新的15ml离心管中，（若提取DNA用于Southern等实验，一般在转移上清时加滤膜，防止样品残渣混入，可保证DNA纯度）。加入4ml

25、氯仿/异戊醇（241），摇匀，平衡，2700转离心15 min。在另一新的15ml离心管中加入5ml预冷的异丙醇，将上清液用移液枪转入此管，在20冷却30 min以上。2700转离心10 min，弃去上清液，用4ml 70%乙醇洗涤，室温保持10 min。2700转离心3 min，倒去上清液。重复步骤7，用4ml 70%乙醇洗涤，室温保持10 min。2700转离心3min，倒去上清液。超净工作台内吹干（3h左右）。加1ml TE缓冲液中溶解，加10l RNase （10mg/ml），在37恒温箱中温育20min。再加100l 3 mol/L NaAc和2ml无水乙醇，2700转离心3min，

26、倒去上清液。超净工作台内吹干（3h左右）。将DNA沉淀溶于150l TE中，置于超净工作台内（3h左右）。将TE溶液转入已灭菌的15ml eppendorf管中,20保存备用。3.5 植物DNA的“一管法”提取方法：称取100mg新鲜植物组织，剪碎置于15ml离心管中，可加入少许无菌石英砂，加入3滴提取缓冲液，用带玻璃钻头的电钻充分研磨匀浆。加入400l提取缓冲液，混匀后置于90水浴中，不时颠倒摇匀。温育20min后，置于冰浴中5min，使组织和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）沉淀，置于4下保存备用。3.6 适用于PCR研究的快速提取法：田间剪取植株新鲜叶片510mg（约2cm长）左右，新鲜叶片放

27、于15ml离心管中，存于冰盒中，根据样品号贴上相应的标签。用剪刀将叶片组织剪细（约0.5cm长）放在点穴式研板中。加入400l DNA提取缓冲液，用玻棒将叶组织研细，直到液体变成深绿色即可。再加400l DNA提取缓冲液，混合均匀，转入一新的15ml离心管（贴上相应的编号）。加400l氯仿，混合均匀后，2400转离心30s，将上清液转入一支新的15ml离心管（贴上相应的编号）。加800l无水乙醇，混匀，2400转离心3min。弃上清。70%乙醇冲洗，风干。用50l TE缓冲液溶解，存于20。取1l用于PCR分析。3.7 棉花等酚类、多糖类物质较多的植物DNA提取法：取2g新鲜幼嫩的叶片放入研钵

28、中，加入液氮后快速、充分研磨，待成极细的粉末状时迅速转入到50ml离心管中。在50ml离心管中加入10ml冰预冷的提取缓冲液，在涡悬振荡器上充分混匀。于4，2700转离心20min，倒去上清液在沉淀中加入5ml裂解缓冲液，在涡旋振荡器上充分混匀。于65水浴锅中温育30min。加入5ml氯仿/异戊醇（24/1），并上下翻转以充分混合。于4，2700转离心5min。转移上层水相至一新的50ml离心管中。重复步骤79一次。加入2/3体积的冰预冷的异丙醇，并上下翻转以充分混合，至20 2h。于4，1200转离心10min。在一新管中加入20ml含80%乙醇15m mol/L NaAc溶液，用玻棒将DN

29、A转入该管（如不能直接用玻棒缠出，可离心后倒出上清，再在其中加入20ml含80%乙醇15m mol/L NaAc溶液），放置20min后稍许离心，移走上清并吸出残存乙醇，室温干燥。加入1 0ml TE（10 m mol/L Tris-HCl pH=8.0、1 m mol/L EDTA）并加入终浓度为20g/L的RnaseA，过夜。风干，用50l TE缓冲液溶解，存于20备用。 3.8 植物DNA的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取法：称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。将粉末转移到的加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65

30、水浴中，温育30min。取出离心管,冷却至室温，加入氯仿、异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300转离心20min。转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000转离心10min，使DNA沉淀于管底。加入1.5-2ml的1mol/L NaCl及5l RNase置于56水浴中过夜。待DNA完全溶解后，加2-3ml 4预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中。用70%乙醇清洗3

31、0min，用离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。将风干的DNA直接在4保存备用或溶于100l TE溶液中于-20保存。三、 试剂配制二苯胺试剂的配制A液：15 g二苯胺溶于100 mL 冰醋酸中,再加15 mL浓硫酸,用棕色瓶保存。如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使用。B液：乙醛的体积分数为0.2%的溶液。将0.1 mL B液加入到10 mL A液中,现配现用。研磨液的配制方法Tris（三羟甲基氨基甲烷）：10.1 g(相对分子质量为121.14),先加50 mL 蒸馏水溶解,用物质的量浓度为2 moL/L 的盐酸调

32、至pH8.0,再加下述药品。NaCl：8.76 g(相对分子质量58.44)EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：37.2 g(相对分子质量372.24)SDS(十二烷基磺酸钠)：20 g(相对分子质量288.3)待上述药品全部溶解后,再用蒸馏水定容至1 000 mL。若在室温低于20 时配制药液,SDS呈沉淀析出,此时需要加温,才能将SDS溶解。如果提前配制的研磨液出现了沉淀,则应加温使沉淀溶解后再使用。四 、DNA纯化及杂质去除4. 1 酚类杂质的去除 对植物中次生产物酚类物质的去除,普遍是在提取液中加入适量的抗氧化剂和螯合剂,防止多酚氧化褐变。在提取DNA 过程中加入巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖

33、醇、谷胱甘肽及抗坏血酸等巯基试剂,抑制氧化反应,避免褐化。在样品液氮研磨及提取缓冲液中加入高分子螯合剂PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 或PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮) 等能络合多酚和萜类物质离心或氯仿抽提出去,有效的防止多酚物质氧化成醌类,避免溶液变褐而具有抗氧化作用。因此在提取液中加入适量的PVP 或PVPP 能提高DNA 的纯度) ,其用量视杂质的多少而定(1 %6 %) ,PVP 同时能有效去除多糖。因此将PVP 和巯基乙醇配合使用并调整用量,能够有效地防止多酚污染。王玉成等认为以上的方法仅对褐化现象较轻者有效,却很难克服一些含酚类化合物丰富的植物,如柽柳、冷杉等树种的褐化。在CTAB 缓冲液加

34、入一定量的硼砂(提取缓冲液含0. 012 5 mol/ L 硼砂、2 % CTAB 、 1. 4 mol/ L NaCl 、巯基乙醇0. 1 mol/ L ,pH值为9. 0) 提取柽柳、冷杉的RNA 取得了良好的效果,而且在提取紫丁香、糖槭、旱柳等植物组织的RNA 时也从未发生褐化10 。4. 2 多糖类杂质的去除 多糖的污染是提取植物DNA 时常遇到的另一棘手的问题11 。植物组织中往往富含多糖, 而多糖的许多理化性质与DNA 很相似,因此很难将它们分开。经典的CsCl 梯度离心能有效的除去植物中多糖,但梯度离心设备昂贵,操作不便且DNA 得率很低。近年国内外有一些去除多糖的相关报道,De

35、llaporta 等认为加入高浓度的 KAc 有利于除去多糖12 ;Fang 等认为在1. 02. 5 mol/ L NaCl 的高盐TE 中,用无水乙醇沉淀DNA 能除去多糖13 ; Sue Porebski 等在沉淀粗提DNA 时,将NaCl 的浓度提高至2. 5 mol/ L 以除去多糖14 ;Candelario 等通过调节材料的取样时期、使用量, 在氯仿处理后加含2 %CTAB 的分离缓冲液, 及延长离心时间等方法来有效去除仙人掌植物的多糖15 ;徐志祥等将DNA 沉淀重悬于30 %乙醇中4 放置过夜,离心, 上清加乙醇至80 %重新沉淀DNA ,能去除多糖和其他杂质16 ;陈大明等

36、利用活细胞中由于细胞区室化多酚类以及其他杂质与DNA 相互隔离的特性,在裂解细胞前用不含 CTAB 的提取缓冲液(0. 14 mol/ L 葡萄糖、3 %可溶性PVP、10 mmol/ L2巯基乙醇) 去除细胞质中大多数生化成分,同时有效地防止多酚类物质被氧化,从而达到排除多酚类等杂质干扰的目的17 ;程运江等先用水饱、乙醚和1. 21. 5 mol/ L Na2 Cl 溶液将大部分多糖去除, 再用2 倍乙醇沉淀DNA 可大大提高效率18 。An Michiels 等用生长24 月的幼苗转移到暗室暗化处理4 周的黄化叶提取DNA 有效地防止多糖污染,同时发现在25 异丙醇过夜沉淀DNA 能减少

37、杂质污染且大大提高产率19 。关于提取DNA 中蛋白质、糖类、多酚等各种杂质对分子生物学后续试验的影响,马小军等和文晓鹏等认为在一定范围内DNA 样品中蛋白质含量的高低, 可能不是影响PCR 扩增的重要因素, 去除RNA 后尚未纯化的DNA 作为模板进行RAPD 扩增也能得到和纯化后一致的条带。但是, 用EcoRI 和HindIII 检测表明, 未纯化的DNA 不能用于酶切20 - 21 。目前检测DNA 的纯度最常用的方法是测定DNA 在230、260、280 nm的吸收值, 通过计算OD 260/ OD 280 来评价DNA 的纯度, 通常认为OD 260/ OD 280 在1. 82.

38、0 表明 DNA 的纯度较好。尽管这种方法用得很普遍,但并不可靠, 因为核酸在260 nm处的吸收很强,只有存在高水平蛋白质杂质时才会引起这2 个波长下吸收值的比值发生明显改变22 。检测DNA 纯度最佳的办法是采用EcoRI、HindIII 等限制性核酸内切酶对DNA 进行酶切消化,只有能被酶切完全并可用作PCR 模板的基因组DNA ,才能证明其纯度高,所含蛋白质、多糖类等杂质少,才能进一步用于AFLP、RFLP、Southern 杂交等分子生物学的研究。五、DNA提取的几种方法(1).浓盐法A. 利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯 纳提取化钠抽提,

39、得到的DNP粘液与含有少量辛醇的 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.B. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿-异醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA. （2）.阴离子去污剂法; 用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA .由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴

40、离子去污剂提取DNA（3）.苯酚抽提法：苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 （4）.水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6

41、M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66% ，80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS. 六、细胞的破碎 细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种：机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。 由于高等动物DNA 主要存在于细胞核与线粒体中，所以提取时有两个困难（高等植物与此类似）： 破碎细胞难；从处死动物分离组织器宫到破碎细胞费时长。在此时期间DNA 可能会被DN ase降解

42、，而动物组织：特别是肌肉组织很难破碎,即使是较易破碎的肝肾等组织也往往使用组织匀浆器，易造成DNA 断裂。 分子量大，一般比细菌的大23个数量级，比病毒的大45个数量。对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。七、鉴定DNA的其他方法用紫外灯照射法鉴定DNA效果很好。具体鉴定方法如下。    1.配制染色剂。用蒸馏水配制万分之五的溴化乙锭(EB)溶液。2.将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上,再滴1滴EB溶液染色。3.将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射(暗室中),可见橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在280 nm处)。4.、大学学的鉴定活细胞DN

43、A甲基绿派洛宁（Methyl green-Pyronin）为碱性染料，它能分别与细胞内的DNA、RNA结合而呈现不同颜色。当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿和染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择结合显示红色。其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易与聚合程度高的DNA结合呈现绿色。而派洛宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色，但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色。即RNA对派洛宁亲和力大，被染成红色，而DNA对甲基绿亲和力大，被染成蓝绿色。八、注意事项1以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠防止血液凝固。2加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作